Гепатологія – 2009. – №2 . – С. 60–65.
Вступ. Хоч впровадження високочутливого методу ІФА для виявлення HBsAg у донорів крові призвело до значного, майже у 100 разів, зменшення випадків гепатиту В, зумовлених інфузіями крові та її компонентів, проблема посттрансфузійного гепатиту залишається актуальною. За даними Й.В. Шахгільдяна [1], у Росії лише 0,3–1% хворих на гострий гепатит В заразилисячерез переливання крові та її компоненти. Аналогічна ситуація спостерігається і в Україні. Але зв’язок з гемотрансфузіями виглядає інакше, якщо проаналізувати,який відсоток їх призводить до зараження реципієнтів. За нашими даними, цей показник аж ніяк не менше 5%.
Головними причинами неповного виявлення вірусоносіїв серед донорів крові є наступне: 1) недостатня чутливість вітчизняних діагностичних тест-систем, призначених для ідентифікації HBsAg; 2) недостатній внутрішній та зовнішній контроль за якістю обстеження донорів; 3) зменшення імунореактивності HBsAg через модифікації амінокислотної послідовності а-детермінанти антигену (мутації S-гену); 4) «вірусоносійство» із малою інтенсивністю реплікації HBVDNA та низьким вмістом HBsAg у сироватці крові; 5) існування так званого «німого» гепатиту В (переважно хронічного) із відсутністю у крові HBsAg [2–5].
Враховуючи, що сучасна організація донорства у нашій країні не гарантує безпечність гемотрансфузій, важливе значення надається максимальному обмеженню показів для переливання крові та її компонентів. Питання це вирішено законодавчо. Відповідно до закону України «Про запобігання захворюваності на синдром набутого імунодефіциту (СНІД) та соціальний захист населення» (Відомості Верховної Ради України, 1992, №11, с.152) «з метою запобігання поширенню ВІЛ-інфекції через донорську кров її переливання застосовується лише у випадках, коли таке медичне втручання є єдиним засобом для врятування життя людини». У всіх інших випадках доцільно використовувати кровозамінники, або власну кров, заготовлену у процесі підготовки до запланованої операції. За нашими даними, попри поширеність в Україні парентеральних гепатитів та СНІДу, принцип обмеження гемотрансфузій лише життєвими показами нерідко безпідставно порушується.
Зараження ГВ можливе і через стовбурові клітини. Тому можна лише вітати створення банків ретроплацентарної крові як сировини для отримання за потреби власних стовбурових клітин..
Досвід передових західних країн свідчить,що якісне обстеження донорів майже усуває небезпеку передачі вірусів гепатиту В та С з кров’ю. Так, наприклад, у Південному Лондоні при тестуванні 21923 взірців крові, відібраної для гемотрансфузій, маркери вірусних гепатитів виявлені не були. Інцидентність інфекцій, що передаються з гемотрансфузіями, складала 0 у 21043 взірцях для гепатиту В та 0 у 21800 взірцях для гепатиту С. Дослідження охопило реципієнтів крові із 22 лікарень. Три пацієнти захворіли на гепатит В у час або після перебування в лікарні, проте не в наслідок переливання крові. Результати дослідження переконують, що ризик зараження через гемотрансфузії у Об’єднаному Королівстві вкрай незначний, госпітальні інфекції з переливанням крові не пов’язані [6]. Методичні рекомендації з гепатиту С,прийняті Американською асоціацією з вивчення хвороб печінки у 2009 році, рекомендують обстежувати на гепатит пацієнтів, в анамнезі яких э згадка про переливання крові, але лише у разі, якщо вони отримали гемотрансфузію до 1992 р.[7]. Отже, високоефективні підходи для боротьби з посттрансфузійним гепатитом розроблені і впроваджені у практику ряду країн.
Відомо, що з методів ідентифікації HBsAg найчутливішим є імуноферментний аналіз, проте можливості його невичерпані. Так, у Росії зареєстрована нова імуноферментна тест-система (ДС-ІФА–HВsAg-0,01), що виявляє HВsAg у концентрації 0,01 МО/мл, а це значно перевищує чутливість розроблених досі діагностичних тест-систем. Зіставлення чутливості нової діагностичної тест-системи із визначенням вірусної ДНК показало, що виявлення HВsAg може випереджати початок детекції ДНК вірусу (100–400 копій/мл) [8,9]. Відкриваються нові можливості для виявлення вірусоносіїв серед донорів крові, повинна стати ефективнішою реєстрація латентних форм інфекції, здається, що нова тест-система краще працюватиме і з мутантними штамами вірусу. Проте навіть така чутлива система не гарантує стовідсоткового виявлення джерел інфекції.
Не забезпечують епідеміологічної безпеки гемотрансфузій навіть молекулярні методи виявлення контамінованої крові. Повна ж відмова у використанні крові випадкових донорів неможлива, оскільки повсюдне створення банків автологічної крові є питанням далекого майбутнього [10]. Тому у ряді країндля обстеження донорів використовують й інші, додаткові маркери інфекції. В першу чергу це стосується anti-HBc. Відомо, що серед осіб, які мають anti-HBc, та навіть anti-HBs (за відсутності HBsAg), зустрічаються вірусоносії. В Україні така технологія обстеження донорів не впроваджена, залишається недостатньо вивченою частота «носійства» антитіл. Що стосується досліджень, виконаних за межами України (і навіть практичного досвіду інших країн), то вони можуть мати лише регіональне значення. До того ж впровадження нового методу потребує його економічного обґрунтування. Саме тому метою нашого дослідження було вивченнячастки донорів з антитілами до HBсAgі HBsAg та встановлення кореляції між наявністю означених антитіл і результатами виявлення DNAHBV.
Матеріал в методи дослідження. Для вивчення частоти зустрічаємості anti-HBs та anti-HBc в донорів, які за даними ІФА не мають HBsAg, обстежено 286 донорів, переважна більшість з них здавали кров вперше.
Попереднє обстеження на HBsAg здійснювали у лабораторіях станцій переливання крові, після чого сироватки, в яких антиген не було виявлено, додатково перевіряли в установах, що приймали участь у дослідженні.
Anti-HBc та anti-HBs визначали методом ІФА за допомогою тест-систем НВО «Диагностические системы» (Росія). Відповідно до інструкції виробника (2009р.) результат дослідження наanti-HBc вважається позитивним, якщо значення оптичної щільності (ОП) досліджуваного взірця дорівнює або менше значення ОП критичного. Проте ми, для більшої вірогідності отриманих даних, розраховували ОП крит. за формулою:
ОП крит. = (середнє знач. ОП К-х 0,5) -0,130,
де 0,5 та 0,130- коефіцієнти, що встановлені підприємством-виробником. Взірці сироваток із значенням ОП лише на 10% нижче значення ОП крит. перевіряли вдруге. Якщо повторні результати були аналогічними, вважалось, що сироватка не міститьanti-HBc. Проте, якщо у досліджуваному взірці одночасно містились anti-HBs, такий результат приймали як вірогідний без додаткової перевірки.
Специфічність визначення anti-HBs, за даними виготовника тест-системи, становить 100% ( за результатами дослідження панелі негативних взірців). У наших попередніх дослідах за допомогою реакції нейтралізації антитіл антигеном, дані про високу специфічність цієї тест-системи підтвердились (у досліджені використовували принцип, на якому базується раніше розроблена реакція ідентифікації антитіл до HBsAg – авторське свідоцтво СРСР № 1091384 [11].
У сироватках крові, що містили anti-HBc або anti-HBs (або обидва види антитіл) визначали DNAHBV якісним методом Real time RT PCR (ПЛР у реальному часі).
Аналогічним чином обстежували хворих на хронічні гепатити (59), в яких етіологія хвороби не була розшифрована, але в сироватці крові були anti-HBc.
Результаті дослідження та їх обговорення. У Львівській області антитіла до HBcAg виявлені у 56 з 290 обстежених донорів крові (19,69%). До цієї кількості увійшли 2 взірця, в яких ОП була всього на 10 та 9,7% менше значення ОП крит. Проте в цих досліджуваних взірцях були виявлені і anti-HBs. Таке «співпадіння», на нашу думку, підтверджує вірогідність результатів визначення anti-HBc.
Частота виявлення у донорів anti-HBs була меншою і становила 10,83%.
Суттєво, що anti-HBs виявлені в сироватці крові лише тих донорів крові, що мали anti-HBc, з фактом «ізольованого» вмісту anti-HBs ми не стикалися.
Отже, загальна частота виявлення антитіл до обох антигенів дорівнює кількості донорів з антитілами до HBсAg. Саме тому створюється враження, що для обстеження донорів на інші,крім HBsAg, маркери достатньо визначення лише anti-HBc (без anti-HBs). Вміст антитіл до anti-HBc коливався у широкому діапазоні, кореляції між вмістом anti-HBc та anti-HBs ми не встановили.
При обстежені сироваток крові,позитивних по anti-HB c та негативних по HBsAg, отриманих від донорів Львівщини,у3 взірцях виявлена DNAHBV(5,36%) Отже, обстеження донорів з anti-HBc дозволяє збільшити частоту виявлення потенційних джерел інфекції серед донорів крові.
Позитивні результати за цією ознакою встановлені у осіб з високим вмістом anti-HBc (таблиця 1), проте впевнено стверджувати, що існує зв’язок між концентрацією антитіл і реплікацію DNAHBV ми не можемо Так само не встановлена кореляція із вмістом anti-HBs у досліджених взірцях сироватки крові.
Таблиця 1. Виявлення реплікації HBVDNA у HBsAg-негативних донорів крові, залежно від вмісту anti-HBc.
|
ОЩ досліджуваних взірців |
Кількість взірців з anti-HBc |
Виявлено HBV DNA |
Кількість взірців з anti-HBc + anti-HBs |
Виявлено HBV DNA |
|
0,240–0,150 |
15 |
0 |
9 |
0 |
|
0,149–0,02 |
18 |
0 |
12 |
0 |
|
0,019–0,010 |
8 |
3 |
0 |
|
|
0,0099–0,008 |
2 |
1 |
0 |
0 |
|
0,0079–0,001 |
13 |
2 |
7 |
0 |
|
Разом |
56 |
3 |
31 |
0 |
Примітка: між ОП та вмістом anti-HBc існує зворотна залежність, тобто вміст антитіл більший у взірцях з меншою оптичною щільністю.
Як видно з табл. 1, всі виявлені вірусоносії мали антитіла лише до HBcAg; у донорів з наявністю anti-HBs у крові позитивна PCR не виявлена. Зрозуміло, ми не стверджуємо, що, антитіла до HBsAg виключають можливість вірусоносійства: добре відомо, що один із варіантів мутації S-гена серологічно проявляється відсутністю HBsAg і наявністю anti-HBs. Проте створюється враження, що наявність «ізольованих» anti-HBc виглядає підозріліше.
При обстежені 69 хворих на хронічні вірусні гепатити невстановленої етіології, що за особливостями клінічного перебігу та результатами лабораторного обстеження виглядали як вірусні, у 16 (23,2%) були виявлені anti-HBc, за відсутності HBsAg. З цих 16 пацієнтів у 2-х виявлена DNAHBV(12,5%). Результати цього дослідження підтверджують доцільність обстеження методом PCR осіб з наявністю anti-HBc.
Відсутність HBsAg у взірцях крові, в яких виявлена DNAHBV, найчастіше зумовлена мутаціями S-гена, інфекція такого типу може не виявлятися комерційними тест-системами. Вважається, що мутації у послідовностях Sгена HBV переважно виникають у вірусах, які належать до генотипів AтаD [12]. Саме ці генотипи HBV поширені в Україні [13,14].
В хворого на гострий гепатит В у періоді розпалу хвороби з’являються антитіла до HBcAg класу IgM(наявні і у разі субклінічного перебігу), поступово відбувається їхня інверсія в IgG; останні є в крові хворих на хронічний гепатит В та в перехворілих [15]. Саме тому обстеження донорів, що мають anti-HBc, методом PCR на наявність у крові ДНК вірусу, на нашу думку, є ефективним заходом для попередження посттрансфузійного гепатиту. Проте виявлення anti-HBc не може замінити обстеження на HBsAg: зустрічаються, хоч і рідко, випадки вірусоносійства, при якому не вдається виявити антитіла до HBcAg.
За даними медичного центру Управління справами Президента РФ [16] ефективним є додаткове обстеження HBsAg-негативних донорів на наявність у крові anti-HBc класуIgM – виявлені в 1% первинних донорів крові. Враховуючи, що антитіла, які належать до імуноглобулінів М, свідчать про активний інфекційний процес, такий захід є цілком доцільним. Отже обстеження донорів крові на антитіла до HBcAgсебе повністю виправдовує.
Сьогодні для виявлення вірусоносіїв найефективнішими вважаються молекулярні методи обстеження, проте і PCR не є панацею: при низькореплікативному варіанті виявити DNAHBV не завжди вдається, але в крові таких хворих може бути HBsAg. З іншого боку, за допомоги PCR можна виявити випадки HbsAg-негативного та серонегативного гепатиту В. Тому лише використання комплексу досліджень, що доповнюють одне одного, може наблизити нас до вирішення проблеми.
Як видно з результатів нашого дослідження, скринінг на наявність anti-HBc значною мірою зменшує загрозу використання контамінованої крові. Проте повне виключення з донорства осіб з anti-HBc навряд на даний час реальне через поширеність їх серед донорів. Тому включення до алгоритму обстеження донорів цього тесту, з наступною перевіркою позитивних взірців сироватки методом PCR, є реальнішим.
Висновки.Поширеність осіб з anti-HBc у крові та виявлення серед останіх вірусоносіїв робить доцільним включення тесту на anti-HBc,з наступною перевіркою позитивних взірців методом PCR, до алгоритму обстеження донорів крові
Література
- Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). – М.: ГОУ ВУНМЦ. МЗ. РФ, 2003. – С. 384
- Kreutz C. Molecular, immunological and clinical properties of mutated hepatitis B viruses // J. Cell. Mol. Med. – 2002. –Vol.6, № 1. – P.113–143.
- Корчинский Н.Ч., Король З.Р. Мутантные штамы вируса гепатита В и их клиническое значение // Сучасні інфекції. – 2006. – №1–2. – С. 36–38.
- Уланова Т.И., YokosawaJ., Пузырев В.Ф. и соавт. Влияние гетерогенности аминокислотной последовательности детерминанты а на антипенные свойства HBsAg вируса гепатита В // Вопросы вирусологии. – 2007. – №3. – С. 13–15.
- Гриза П.В.Гемотрансмісивна передача гепатитівВ та С: проблеми та шляхи вирішення // Гепатологія.– 2009.–№1 (3).–С.66–73.
- Regan F., Hewwitt P., Barbabra j.a. et al. Prospective investigation of transfusion transmitted infection in recipients of 20000 unit of blood. TTI Study Group // BMJ.–2000. –Feb 12; 320. – P.403–406.
- AASLD Practice guidelines. Diagnosis, Management.and Treatment of Hepatitis C:An Update// Hepatolody.–2009.–Vol.49,N4.–P.1335 – 1371.
- Кувшинова И.Н., Кулешова Е.А.,Рукавишников М.Ю. Чувствительность набора реагентов «HBsAg–ИФА–Бест»// Новости «Вектор-Бест». Информационный бюллетень. – №4. – 2007. – С 2–4.
- Егорова Н.И., Пыренкова И.Ю., Иголкина С.Н. и соавт. Високочувствительный ИФА-тест для выявления HBsAg как альтернатива молекулярно-генетическим методам при ранней диагностике гепатита В // Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Материалы VIIнауч.–практич. конференции. –М., 2007.– С. 21–22.
- Мамедов М.К.,Михайлов М.И., Т.А.Семенко и соавт. Трансфузионные вирусные гепатиты: традиционные и нетрадиционные аспекты медико-социального значения // Мир вирусных гепатитов. – 2005. – №2.– 4–12.
- Герасун Б.А. Способ идентификации антител к поверхностному антигену вируса гепатита Вв реакции нейтрализации. Автор.свид. СССР №1091384.
- GutierrezC., DevesaM., LoureiroC.L. etal. Molecular and serological evaluation of surface antigen negative hepatitis B virus infection in blood donors from Venezuela // J. Med. Virol. – 2004. – Vol. 73, № 2. – Р. 200–207.
- Малый В.П., Лядова Т.И., Чуланов В.П. Влияние генотипов HBV на динамику регуляторных цитокинов у больных острым вирусным гепатитом В// Гепатологія.– 2008.– №1.– 73–81.
- Тимкович М.А., Малий В.П.Генетическая вариабельность НВV и иммунное реагирование организма при НВV инфекции//Гепатологія.– 2008.– №1.–C.66– 72.
- Герасун Б.А., Ворожбит О.Б., Грицко Р.Ю. Сучасні підходи до специфічної діагностики гепатиту В // Гепатологія.– 2008.– №2.– С. 72 – 79.
- Малышев В.С., Федотова В.Д, Волков Н.Е. и соавт. Сравнительный анализ тестирования на маркеры вирусовгепатита В,С и Gсреди доноров крови и некоторых групп риска// Клиническая лабораторная диагностика.– 1997.– №6.– С.64–65.
Современные подходы к предупреждению посттрансфузионного гепатита В
Б.А. Герасун, Л.В.Мороз, Р.Ю. Грицко
Изучена частота выявленияanti-HBc у доноров крови, рассматривается целесообразность включения теста в алгоритм обследования доноров.
Ключевые слова: обследование доноров, посттрансузионный гепатит,HBsAg, anti-HBc.
Modern approaches to prevention of posttransfuzial hepatitis B
B.A. Herasun, L.V.Moroz, R.Ju. Hrytsko
Frequency of revealing of anti-HBcin blood donors is researched. Expedience of including of test in the algorhytm of examination of donors.
Keywords: examination of donors, posttransfuzional hepatitis, HbsAg, anti-HBc.