Гепатологія – 2008. – № 1. – С. 97–105.
Хронічні гепатити супроводжуються автоімунними процесами. Про це, зокрема, свідчить виявлення у таких хворих широкого спектру автоантитіл. Частіше за інших виявляються антинуклеарні антитіла (АНА) різної специфічності, в т.ч. до нативної ДНК і екстрагованих ядерних антигенів (рибонуклеопротеїдів та ін.). Антитіла до ДНК зв’язують і активують комплемент і тому сприяють руйнуванню клітин, активують нейтрофіли і макрофаги [1]. Для системних васкулітів, що виникають при хронічних гепатитах, типові антитіла до цитоплазми нейтрофілів (АНЦА), зазвичай протеази-3 і мієлопероксидази. Відносно недавно у хворих на ХГС виявлені нові автоантигени, що відносяться до інших цитоплазматичних і перинуклеарних структур нейтрофілів [2,3]. Не дивлячись на те, що роль АНЦА в розвитку васкулітів не до кінця зрозуміла, не викликає сумнівів те, що їх патогенетичне значення пов’язане з антиендотеліальною активністю, до того ж вони здатні викликати активацію нейтрофілів [4]. Мішені АНЦА продовжують вивчатися і спектр їх розширюється. У патогенезі автоіммунних реакцій при хронічних вірусних гепатитах (ХВГ) важливу роль грає тропізм HBV і HCV до лімфоцитів: мононуклеарні клітини крові, як і гепатоцити, служать мішенню для даних вірусів. Має значення і те, що вбудовування антигенів вірусу в поверхневі мембрани клітин призводить до зміни HLA і утворення комбінованих антигенів з властивостями автоантигенів. Антигенна стимуляція В-лімфоцитів CD-5 супроводжується посиленим синтезом в печінці поліклональних і моноклональних IgM (антитіла до Fc- фрагменту IgG – ревматоїдний фактор), що реагують з anti-HCV IgG утворенням змішаних кріоглобулінів. Змішана кріоглобулінемія визначається майже у половини хворих на ХГС, а RNA HCV є у більшості хворих з кріоглобулінемічним мезангіокапілярним гломерулонефритом і геморагічним васкулітом [5,6,7,8,9,10].
Хронічний гепатит С часто маніфестує системним васкулітом з пурпурою і нефропатією, рідше виникає синдром Рейно [11,12,13,14]. Терапія хворих на хронічний вірусний гепатит з автоімунними процесами розроблена недостатньо, зазвичай, особливо при системних васкулітах, застосовують глюкокортикостероїдні гормони і цитостатики, що часто небажано або протипоказано хворим з інтенсивною вірусною реплікацією.
У даному повідомленні пропонується новий спосіб лікування таких хворих за допомогою внутрішньошкірної імунізації автолейкоцитами. Метод застосовується самостійно або в комплексній терапії (ангіопротектори, противірусні препарати, гепатопротектори).
Як прототип способу можна розглядати розроблений В.І. Говалло метод профілактики самовільних викиднів шляхом внутрішньошкірної імунізації вагітної жінки лімфоцитами біологічного батька дитини (”навчальний чинник”). Після такої імунізації до того неімунні, по відношенню до антигенів плоду, лімфоцити вагітної жінки ставали сенсибілізованими, в наслідок чого відбувалася опосередкована стабілізація гормонального дисбалансу [14,15].
У нашій роботі для зменшення інтенсивності автоіммунних процесів використовувалися автогенні лейкоцити. Проте обидва підходи (не дивлячись на принципові відмінності між ними) об’єднує те, що імунізація лейкоцитами / лімфоцитами застосовується з метою корекції особливостей імунологічних дисрегуляторних процесів.
Матеріал і методи
Проліковано 42 пацієнти (12 ХГВ і 30 ХГС), з них у 26 спостерігалися явищами васкуліту, в т.ч. 19 пацієнтів з судинними ураженнями шкіри. Серед останніх троє з дермальним некротизуючим васкулітом, 10 з геморагічним артеріолітом Рюїтера, один хворий з важким геморагічним некрозом і 5 пацієнтів з часто рецидивуючим уртикарним васкулітом. Підвищений рівень AНA виявлено у 27 пацієнтів в титрі ≥ 1:80 (норма до 1:80), а кріоглобулінів – у половини обстежених.
Методика внутрішньошкірної імунізації автолейкоцитами
1. Виділення автолейкоцитів.
Лейкоцити виділяли з гепаринізованої венозної крові. Для цього венозну кров в об’ємі 10—50 мл (залежно від важкості і тривалості хвороби) набирали в шприц або флакон з гепарином з розрахунку 50 од. гепарину на 10 мл крові. Розливали по пробірках і відстоювали при t 37°C на протязі 90—100 хв (залежно від показників ШОЕ). З плазми виділяли лейкоцити, двічі відмивали в надлишку охолодженого 0,9% розчину NaCl шляхом центрифугування при 200g протягом 10 хв. Осад ресуспендували в 1,0 мл розчину NaCl. Ніяких інших компонентів, в т.ч. тих, що зазвичай застосовуються для створення градієнта щільності, ми не використовували. Всі етапи роботи проводилися стерильно, а маніпуляції з лейкоцитами у ламінарному боксі. Кількість живих клітин, отриманих за допомогою описаної методики, перевищує 80%. Деякий домішок еритроцитів, неминучий при такому отриманні лейкоцитарної маси, на результати лікування не впливає.
2. Імунізація.
Суспензію автоклітин вводили пацієнтам внутрішньошкірно по 0,1мл в 10 точок в шкіру спини (між лопатками).
Результати оцінювали за ступенем вираженості клінічних проявів до імунізації та через 24, 48, 72 години після неї, а також у віддалені терміни (через 1, 3, 6 місяців, 1-4 роки). Враховували вираженість проявів шкірного васкуліту, інтенсивність артралгій при суглобових ураженнях, функціональний стан нирок при гломерулонефриті. Безпосередньо перед процедурою і через 48—72 години після неї визначали вміст AНA методом ІФА.
Паралельно трьох пацієнтів обстежували в лабораторії “Доктора Редгера” (Берлін, Німеччина) на наявність АНА і АНЦА методом імунофлюоресценції. Кількість кріоглобулінів визначали спектрофотометрично методом E. Kalovidoris (1983). Зіставляли результати гематологічних і біохімічних досліджень. У чотирьох хворих проводили термографію уражених ділянок до і після автоімунізації.
Пацієнти добре переносили імунізацію автолейкоцитами, видимі місцеві і загальні реакції були відсутні.
Результати та обговорення
В результаті лікування у більшості хворих (39 із 42; 92,9%) наступило покращення, яке проявлялося зниженням загальної слабкості, нормалізацією активності АлАТ, прискоренням зворотного розвитку висипу у хворих з васкулітом, зниженням рівня кріоглобулінів, ремісією різної тривалості тощо. Нижче наводимо клінічні спостереження, що ілюструють ефективність даного методу лікування.
Хворий Р., 46 років, поступив на лікування в 1998 р. з приводу суперінфекції дельта. Протягом 12 місяців отримував Інтрон-А по 5 млн. на добу. В результаті лікування маркери реплікації (DNA HBV, RNA HDV) зникли, активність АлАТ нормалізувалася, загальний стан покращав. Через 7 місяців після закінчення лікування, за відсутності DNA HBV, періодично стала підвищуватися активність АлАТ, з’явилися артралгії, після теплових процедур (ванна, душ) – розеольозний висип. При обстеженні в лабораторії “Доктора Редгера” (Берлін) методом іммунофлюоресценції виявлені AНA в титрі 1:80 (норма – до 1:80). При повторному обстеженні в цій же лабораторії через 72 години після імунізації автолейкоцитами, вищевказані автоантитіла не виявлені. Артралгії припинилися, перестали виникати висипання після теплових процедур. Проте, як і раніше, періодично виявлялося помірне підвищення активності АлАТ (термін спостереження 4 роки).
Хвора Г., 50 років, з приводу ХГС отримувала пегінтрон у дозі 80 мг/ тиждень і ребетол по 600 мг /добу. Через 4 місяці від початку лікування титр AНA з 1:80 (початковий рівень) підвищився до 1:1280. Внутрішньошкірне введення автолейкоцитів ефекту не дало. Противірусна терапія була припинена. Через 8 місяців пацієнтка звернулася зі скаргами на загальну слабкість і артралгії. Обстежена методом іммунофлюоресценції в лабораторії “Доктора Редгера”, виявлені AНA у титрі 1:80, флюоресцентний малюнок ніжно-гранулярний (трактується як вказівка на можливий початок автоіммунного захворювання); AНA-мітози – негативні, цитоплазма –виявлені АНЦА (як правило мітохондріальні і відповідно Jo-1AT). Через 72 години після імунізації лейкоцитами при дослідженні в тій же лабораторії автоіммунні антитіла перестали визначатися. Одночасно припинилися артралгії. Ремісія утримується 3 роки (період спостереження).
У хворої Д., 1968 р.н., з діагнозом ХГС (HCV RNA +; генотип 1b) та неходжкінська лімфома розвинувся тяжкий геморагічний ваксуліт з некрозом (уражено більше 15% поверхні шкіри) – фото 1, 2. Введення автолейкоцитів у даному випадку виявилося безрезультатним.
Фото 1.
Фото 2.
Хворий Б., 38 років, поступив на лікування з діагнозом „ХГВ, часто рецидивуючий васкуліт Рюїтера”. Протягом останніх 3 років регулярно (1-2 рази на місяць) з’являється шкірний висип. Пацієнт був госпіталізований в ІКЛ на 3-й день загострення. На шкірі нижніх кінцівок, більше в області гомілок, рясні набряклі запальні плями (3-5 мм) і дрібний геморагічний висип. Загальний стан незначно порушений. Через 8 годин після імунізації на шкірі передпліч, переважно біля місць введення лейкоцитів, з’явилися крупніші набряклі запальні плями розміром 6-7 мм. Проте, вже через 2 години вони безслідно зникли, швидко став згасати і висип на ногах. У подальшому, протягом 2 років (період спостереження), загострень не було.
Детальнішого розгляду заслуговують результати лікування 3-х хворих із важкою кріоглобулінемією. Наводимо короткі описи цих спостережень.
Хворий К., 42 р., діагноз: ХГС (HCV RNA +, генотип 3а), кріоглобулінемія: гломерулонефрит, геморагічний васкуліт, що часто загострюється (шкірно-суглобова форма). У стаціонарі, в день госпіталізації, чергове загострення. З’явився сильний біль і в подальшому крововилив в другому пальці лівої ноги; через дві години – набряк і гіперемія кистей рук і лівої стопи. У зв’язку з цим проведена імунізація автолейкоцитами (через 4 години після початку загострення). Вже через 18 годин зона гіперемії скоротилася приблизно на 75-80%, різко зменшилася набряклість. Відмічено прискорення зворотного розвитку «старих» елементів висипу. Через 10 днів – повторний рецидив, клінічний перебіг якого був значно легшим. Зроблено повторну імунізацію. Через 24 години висипання і набряки зникли повністю. Надалі проведено ще дві імунізації. Частота загострень зменшилася, клінічний перебіг їх став легшим, з швидким зворотним розвитком. Ефект частковий, стійкої ремісії добитися не вдалося. Разом з тим досягнуто значне зменшення явищ нефропатії: стабільно висока концентрація білка в сечі (3-3,5 г/л) після імунізації знизилася до 0,47 г/л і надалі утримувалася в межах від 0,2 до 0,5 г/л (тривалість спостереження 7 місяців).
Хвора М., 60 р., діагноз: хронічний гепатит С (HCV RNA +, генотип 1a), кріоглобулінемія, тяжкий геморрагічний васкуліт з частими загостреннями. Ремісія у даної пацієнтки наступила лише після 4—х кратної імунізації з інтервалом в 1–3 тижні (фото 3, 4, 5).
Фото 3. Хвора М., 60 р. Шкірні зміни до імунізації
Фото 4. Хвора М., 60 р. Шкірні зміни через 48 годин після імунізації
Фото 5. Хвора М., 60 р. Шкірні зміни через 72 години після імунізації
Результати дослідження холодових проб у хворої М. 60 р. до і після лікування представлені в таблиці 1.
Таблиця 1. Результати дослідження холодових проб у хворої М. 60 р.,до і після лікування.
| Види кріопроб |
До лікування |
Після імунізації |
| Холодовий преципітат плазми |
+++++ |
+ |
| Холодові автогемаглютиніни (титр) |
1:128 |
1:8 (норма) |
| Холодові ізогемаглютиніни (титр) |
1:64 |
1:32 |
| Кріоглобуліни (г/л) |
1,46 |
0,67 |
Хвора Ф., 40 р. в анамнезі гострий гепатит В., в даний час HBsAg, HBV DNA не виявлені, HBcAb присутні. Важка форма кріоглобулінемії. У зв’язку із загостренням госпіталізована в ревматологічне відділення, де отримувала терапію ГКСГ, цитостатичними препаратами, плазмаферез. Виписана із значним покращенням. Проте продовжувала утримуватися болючість дрібних суглобів рук; чутливість до холоду, хоч і зменшилася, продовжувала турбувати хвору. Зберігався багрово-синюшний відтінок кистей рук і кінчика носа. За два тижні у стадії субкомпенсації проведена імунізація автолейкоцитами. Ефект наступив швидко: покращав загальний стан, зменшився ціаноз верхніх кінцівок (на 80%); припинилися болі в суглобах, значно покращала переносимість холоду. За даними термографії уражених ділянок, гіпотермія з -5 °С зменшилася до -2 °С. Активність АлАТ з 1,7 млм /л/год знизилася до 0,45 млм/л/год.
У більшості хворих внутрішньошкірне введення автореактивних лейкоцитів супроводжувалося зменшенням кількості АНА (при дослідженні вже через 24—72 години). Результати дослідження наведені в таблиці 2.
Таблиця 2. Титри AНA до і через 72 години після внутрішньошкірного введення автолейкоцитів
|
Титри AНА після авто імунізації |
|||||||
|
0* |
1:20 |
1:40 |
1:80 |
1:160 |
1:1280 |
Всього пацієнтів n, 23 |
|
|
1:80 |
6 |
6 |
|||||
|
1:160 |
3 |
2 |
5 |
||||
|
1:320 |
3 |
3 |
2 |
8 |
|||
|
1:640 |
2 |
1 |
3 |
||||
|
1:1280 |
1 |
1 |
|||||
* – число хворих з відповідним титром АНА.
З наведених в таблиці даних видно, що у хворих з початковим титром АНА 1:80 після імунізації антитіла виявити взагалі не вдавалося. У інших – кратність зниження складала 4—16. І тільки в одному спостереженні досягнути позитивного ефекту не вдалося. У загальному, даний метод лікування, як видно з результатів представлених у таблиці 2 і наведених вище клінічних спостережень, зарекомендував себе позитивно.
Ефективність внутрішньошкірної імунізації автолейкоцитами можна пояснити комплексною дією автореактивних клітин на механізми імунної відповіді. Відомо, що клітини, які були ізольовані з організму і піддавалися навіть простим, малотравмуючим маніпуляціям, певною мірою стають для організму чужими. Мабуть, це підсилює імунологічне реагування, можливо за рахунок активації неспецифічних чинників імунітету (система комплементу, макрофаги та ін.). Ймовірно, що в умовах внутрішньошкірної імунізації лімфоцит периферичної крові втрачає частину захисних механізмів (страждає здатність до зміни форми і «маскування» рецепторів). Можливо, має місце і перехресне реагування за рахунок часткової ідентичності антигенних структур. Так чи інакше, але лише взаємодією між імунізуючими клітинами (мішень) і автоантитілами можна пояснити досить швидке зниження концентрації останніх. На користь такої гіпотези свідчить і те, що в дослідах in vitro АНА реагують з лейкоцитами; для виявлення АНЦА як субстрат використовують фіксовані етанолом нейтрофіли. Проте, лише взаємодією з антитілами не можна пояснити віддалені результати лікування. Відомо, що Т-лімфоцити можуть пасивно переносити автоіммунні хвороби [15]. З цього виходить, що при внутрішньошкірному введенні автореактивні клітини можуть викликати стан активності клітинної лімфоцитарно опосередкованої імунної відповіді, тобто запускати противірусний нагляд, за рахунок генерації цитотоксичних лімфоцитів [4,15,16]. Важливим є і процес корекції сітки Ерне – ідіотип-антиідіотипічної регуляції імунної відповіді, що підтверджується зростанням антиідіотипічних антитіл в сироватці крові хворих після лейкоцитарної автоімунізації [4,15]. Ще один механізм може включитися при цій імунній маніпуляції: активація CD3+, CD4+, CD25+-лімфоцитів, а також CD3+, CD8+, CD28+-лімфоцитів, одночасно з блокуванням Fc-рецепторів, а також глікопротеїнових, лектинових рецепторів на В-лімфоцитах [1,15,16].
Відомо також, що в периферичній крові дорослих людей міститься певна кількість стовбурових клітин [4,15]. Не виключено, що при внутрішньошкірному введенні вони можуть сприяти регенерації судин. В усякому разі, на таку можливість вказує динаміка відновних процесів у хворих з ураженням дрібних судин шкіри.
Література
- Клиническая иммуннология и аллергология. Под ред. Г. Лолора-младшего, Т. Фишера, Д. Адельмана . // Перевод с англ. М., Практика, 2000. – 806 с.
- Чоп’як В.В., Господарський I.Я. Клінічний протокол надання медичної допомоги хворим на поліклонову кріоглобулінемію//Метод.рекомендації.—К.,2005.—23 с.
- Lamprecht P, Gutzeit O, Csernok E. et al. Prevalence of ANCA in mixed cryoglobulinemia and chronic hepatitis C virus infection // Clin. Exp. Rheumatol. – 2003. – Vol. 21. – Р. 89—94.
- Насонов Е.Л., Баранов А.А., Шишкина Н.П. Васкулиты и васкулопатии. – Ярославль: Верхняя Волга, 1999. – 616 с.
- Вермель А.Е. Криоглобулины и криоглобулинемия // Клин. Мед.— 2000.— №12.– С.14—19.
- Козловская Л.В., Мухин Н.А., Гордовская Н.Б. и соавт. Факторы риска прогрессирования криоглобулинемического гломерулонефрита, связанного с вирусом гепатита С // Клин. мед. – 2001. – № 4. – С. 32—35.
- Константинова Н.А. // Криоглобулины и патология.— М.:1999.—176с
- Малый В.П. HCV-инфекция (острая и хроническая) / / Киев., — 2005. — 295 с.
- Мухин Н.А., Козловская Л.В., Малышко Е.Ю. Криоглобулинемический нефрит, ассоциированный с хронической инфекцией вируса гепатита С // Тер. арх. — 2000. — №6. — С.1—5.
- Ferri C., Zignego A.L., Pileri S.A. Cryoglobulins // J. Clin. Pathol.— January 1, 2002.— V.55 (1).— P.4—13.
- Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь – вирусные гепатиты. Русско-украинское издание. Львов: ЛДМУ, 2000 – 584 с.
- Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей // Перевод с англ. М. Гэотар, Медицина, 1999. –— 864 с.
- Renversez J.C., Roussel S., Valle M.L., Lambert P.H. // Antiglobulins, cryoglobulins and glomerulonephritis// Ed. By ponticelly C., Minetti L., D’Amico G.D. — Dordrecht, Boston, Lancaster: Martinus nijhooff.—1996 — P.147—160.
- Говалло В.И., Сидельникова В.М. Иммунизация беременных женщин аллогенными лимфоцитами мужа как метод профилактики самопроизвольных выкидышей // Акуш. и гин. — 1983. — №12. — С. 25—27.
- Якобисяк М. Імунологія // переклад з польської під ред. В.В. Чоп’як. — Вінниця: Нова книга, 2004. — 672 с. (укр.)
- Trendelenburg M., Schifferli J. Cryoglobulins are not essential // Ann Rheum Dis. — 1998. — V.57. — P.3—5.
Лечение аутоимунных нарушений при хронических гепатитах с помощью иммунизации аутолейкоцитами
Б.А. Герасун, О.Б. Ворожбыт, В.В. Чопяк.
Разработан новый оригинальный метод лечения больных ХГ с аутоиммунными проявлениями путем внутрикожной иммунизации аутолейкоцитами. Установлено, что в результате применения данного метода лечения у большинства больных достоверно уменьшилось содержание ANA и криоглобулинов в крови, а у больных с кожным васкулитом и гломерулонефритом наступило клиническое улучшение. Побочный эффект от лечения не наблюдался. Метод может использоваться как монотерапия так и в комплексном лечении больных ХГ с внепеченочными поражениями.
Ключевые слова: Хронический гепатит, внепеченочные поражения, криоглобулинемия.
Treatment of autoimmune process at chronic hepatitis by immunization of autoleukocytes
В.А. Herasun, О.B. Vorozhbyt, V.V. Chopyak
The new method of decreasing intensity of autoimmune process by means of intraskin introduction of autoleukocytes was developed. As a result of treatment most patients got better: decrease of general weakness, normalization of activity of AlAT, acceleration of reverse development of rush in patients with vasculitis, remission of different duration, essential decrease of titre of ANA in serum of blood.As well clinical improvement of various duration in patients with cutaneous vasculitis who didn’t have relapses after treatment or interval between them increased. Side effects after intrascin introduction of own leukocytes didn’t occur. Method can be used separately and in complex therapy of patients with chronic hepatitis with extrahepatic manifestations
Key words: chronic hepatitis, extrahepathic manifestations, cryoglobulinemia.