Герасун Б.А., Ворожбит О.Б., Грицко Р.Ю. та інш. Специфічна діагностика ге-патиту С.

Гепатологія – 2009. – № 1 – С. 79–87.

Під час вірусного гепатиту С (ГС) одночасно відбувається персистенція збудника хвороби та антитіл до нього. Саме це стимулювало розробку діагностичних тест-систем для виявлення anti-HCV: антитіла трактували як свідчення активного інфекційного процесу. З часом стало зрозумілим, що між наявністю антитіл та вірусу немає абсолютної кореляції. Хоча anti-HCV наявні у більшості хворих на ГС (співпадіння сягає 90 %), проте не у всіх хворих з антитілами є збудник хвороби. Відомо, що приблизно 20–30 % хворих на гострий ГС спонтанно одужують, а антитіла в них зберігаються протягом 8–10 років, можливо й довше. До того ж в частині досліджень спостерігають несправжньо позитивні результати.

Імовірність хибних позитивних результатів дослідження, або розходження результатів під час використання різних тест-систем, створює серйозну діагностичну проблему. У наших спостереженнях найчастіше хибні позитивні результати виникали у разі обстеження хворих з наявністю у крові підвищеного рівня ревматоїдного фактору, значної концентрації кріоглобулінів, високого вмісту холестерину. За даними І.В. Шахгільдяна і співав. несправжні позитивні результати частіше виникають у онкологічних хворих, пацієнтів з вираженою імуносупресією, хворих на сифіліс [1]. Часто такі результати спостерігають під час автоімунних хвороб, особливо автоімунного гепатиту 2-го типу [2]. Частота неспецифічних результатів дослідження залежить також від якості діагностичних тест-систем і в середньому становить 15–20 %. Саме тому алгоритм специфічної діагностики [3] передбачає перевірку позитивних результатів дослідження (рис.1).
3.inddДля перевірки виявлених антитіл найчастіше використовують імуноблотинг – метод, що полягає на виявленні антитіл до окремих антигенів, кодованих різними зонами RNA HCV. Вірусна РНК має одну відкриту рамку зчитування, яка кодує поліпротеїн-попередник (3010–3033 амінокислотних залишків), з якого під впливом вірусних та клітинних протеаз утворюються структурні (core, Е1, Е2, р7) та неструктурні білки (NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Відповідні антигени нанесені на нітроцелюлярну мебрану. Після інкубації антигенів із зразком, що містить шукані антитіла, їх виявляють за допомогою кон’югата – антитіл проти імуноглобуліну людини (аналогічно як у звичайному ІФА). Наявність антитіл до кількох антигенів збудника розглядають як позитивний результат дослідження. Проте цей метод має певні обмеження. У результаті вивчення ролі імуноблотингу, як підтверджуючого тесту, встановлено, що його чутливість менша ніж ІФА, через що негативний результат дослідження не виключає наявності антитіл [4]. Одним із можливих способів вирішення цієї проблеми є ІФА із тест-системою, що виявляє антитіла до різних антигенів збудника. Використання окремих пептидів дозволяє отримати чіткіші результати, а спостереження за динамікою антитіл має додаткове діагностичне значення. Фактично такі тест-системи є дешевою альтернативою імуноблотингу, що дозволяє аналізувати співвідношення антитіл до окремих антигенів HCV у різні періоди хвороби [5].

Окрім хибних позитивних результатів дослідження, слід враховувати й можливість негативних результатів під час дослідження взірців, що містять вірус ГС. Відомі такі 3 ситуації: 1) початковий період хвороби – серонегативна фаза гострого гепатиту, фаза «вікна»; 2) тривала затримка сероінверсії у хворих, що отримують імуносупресивну терапію; 3) гірше розпізнавання антигенів деяких генотипів HCV (переважно 3-го та 4-го). Встановлено, що антигени з ділянки NS3 1-го генотипу ГС у 5 разів ефективніше розпізнають антитіла до 1-го генотипу вірусу, ніж до 2-го та 3-го [5].

Про негативний вплив затримки сероінверсії на якість діагностики переконливо свідчить досвід станцій переливання крові: після введення в Україні карантинізації плазми суттєво зросла якість виявлення донорів, інфікованих HCV. Так, у 2007 р. в Україні на карантинізації перебувало 144 778,7 л свіжозамороженої плазми. Після повторного обстеження донорів (закінчення терміну карантинізації) додатково утилізовано 291,9 л, через появу у донорів антитіл до вірусу ГС. Це становить 14,5 % від усієї забракованої донорської плазми [6, 7]. Антитіла до вірусу ГС найчастіше виявляють через 54–193 дні від початку хвороби [6].

У клінічній практиці в хворих на ГС найчастіше визначають anti-HCV. Інтерпретація результатів такого обстеження за допомогою визначення HCV RNA подані у таблиці 1.

Таблиця 1. Клінічне значення виявлення anti-HCV.

anti-HCV

RNA HCV

Клінічне значення

+

Реконвалесценція або перенесений раніше ГС

+

+

Активний інфекційний процес (гострий або хронічний ГС)

+

Початок хвороби гострий або хронічний ГС у хворого із імунодефіцитом

Розглянемо діагностичне значення ідентифікації антитіл до окремих вірусних білків.

Anti-HCV core. Наявність у високій концентрації (титр 1:1 000) розглядають як реальна ознака реплікації HCV RNA.

Особливе значення ми надаємо виявленню anti-HCV core IgМ: за нашими даними їхня присутність у сироватці крові майже в 100 % спостережень співпадає з наявністю у досліджуваних взірцях РНК вірусу. За іншими даними ця частка є дещо меншою, та все ж високою.

Про кореляцію між виявленням anti-HCV core IgМ та реплікацією HCV RNA свідчать результати дослідження, в якому встановлено, що визначення кількісного вмісту цих антитіл можна застосувати як додатковий критерій досягнення вірусологічної відповіді на лікування. Так, у 20,8 % хворих зі стійкою вірусологічною відповіддю на противірусну терапію anti-HCV core IgМ перестають визначатися вже після четвертого тижня лікування; ще 41,7 % пацієнтів звільняються від них до 12 тижня (разом понад 62 %). У інших пацієнтів вміст anti-HCV core IgМ у крові на цей момент стає незначним. Отже, зникнення anti-HCV core IgМ або суттєве зменшення їх вмісту в крові дозволяє прогнозувати стійку вірусологічну відповідь (аналогічно контролю за вмістом HCV RNA, співпадають навіть терміни). У хворих із нестійкою відповіддю на лікування антитіла зберігаються значно довше, титр їх зменшується повільніше (рис. 2). Під час рецидивів вміст антитіл швидко зростає [8].
image27Рис. 2. Динаміка анти-HCV core класу М та G у порівнянні з АлАТ при гострому гепатиті C з розвитком хронізації (інформаційні матеріалию Нижній Новгород, 2003).

Отже, наявність у крові anti-HCV core IgМ є ознакою гострої або хронічної інфекції, тоді як anti-HCV загальні свідчать про можливе інфікування або раніше перенесену хворобу.

Особливо часто реплікацію HCV RNA спостерігають у хворих, у яких крім антитіл до структурних білків вірусу (core), є антитіла до неструктурних протеїнів.

Визначення anti-HCV core використовують як підтверджуючий тест у разі невизначеного результату дослідження або при суперечливих результатах ідентифікації антитіл до ГС за допомогою різних тест-систем.

Антитіла до неструктурних білків HCV (NS3, NS4, NS5). Вважають, що антитіла до NS3 можуть бути самостійним діагностичним маркером, їх тривала присутність у значній концентрації має прогностичне значення – вказує на високу загрозу хронізації. Антитіла до NS4 зазвичай виявляють пізніше, ніж антитіла до структурних протеїнів та anti-NS3, тому вважають, що вони свідчать про тривалий інфекційний процес. Значення NS3 і NS4 для розмежування гострого та хронічного ГС потребує подальшого вивчення.

Із включенням до тест-систем білків, кодованих регіоном генома HCV NS5, чутливість діагностичних тест-систем суттєво збільшилась. Проте відомо, що у цій ділянці вірусу є послідовності, що неспецифічно реагують з антитілами у сироватці крові людини [5]. Отже, підвищення чутливості призвело до збільшення хибно-позитивних результатів. Тому доцільність включення білків NS5 у діагностичні тест-системи у деяких дослідників викликає сумніви.

Про значення окремих видів антитіл свідчить зіставлення діагностичної ефективності різних поколінь тест-систем. Системи першого покоління виявляли антитіла до регіонів NS3–NS4 – позитивні результаті реєстрували лише через кілька місяців після зараження, період сероінверсії досить часто затягувався до року. Внесення у діагностичні системи core білка «прискорило» період сероконверсії до 2–6 місяців і підвищило чутливість тест-систем. Проте значна тривалість встановлення факту хвороби (понад 2 місяця) робить системи першого та другого поколінь не придатними для діагнозу гострого ГС. Системи третього покоління є чутливішими, проте часто дають хибні позитивні результати. Отже розмежування гострого та хронічного ГС за допомогою діагностичних тест-систем залишається складною діагностичною проблемою.

Визначення антигенів HCV. Перші комерційні тест-системи для визначення антигенів ГС за допомогою твердофазного ІФА з’явилися у 1999 році. Створені вони на підставі моноклональних антитіл проти core антигену. Але ці тест-системи себе не виправдали через низький вміст антигену у сироватці крові хворої людини. Лише нещодавно після розробки нових методичних підходів з’явилися чутливі тест-системи. В Україні вони ще не дістали широкого впровадження, хоча виявлення антигену є перспективнішим, адже дозволяє діагностувати хворобу ще до появи антитіл (у середньому на 26 днів раніше) [5].

Генодіагностика ГС. Основний спосіб специфічної діагностики. Можливості генної діагностики дозволяють не тільки виявити збудник хвороби задовго до появи антитіл, але й встановити його генотип, що надзвичайно важливо для противірусної терапії хворого на ГС [9].

Окрім того методи генної діагностики дозволяють оцінити кількість геномної РНК – динамічне спостереження за інтенсивністю реплікації характеризує ефективність лікування і є обов’язковою умовою успішної терапії. Відомо, що тривалість противірусної терапії залежить від генотипу вірусу, вихідного рівня реплікації (характеризує концентрацію вірусу в крові) та темпів її пригнічення. Клінічний досвід свідчить, що більше шансів на стійку вірусологічну відповідь мають пацієнти з низьким вмістом вірусу в крові та наявністю 2-го або 3-го генотипу вірусу.

Сьогодні найпоширенішим методом кількісного визначення HCV RNA є Real-time PCR (ПЛР у реальному часі). Методи генної діагностики, зокрема ПЛР, дозволяють діагностувати і так званий серонегативний ГC. Саме тому ПЛР є незамінною для діагностики ГС у пацієнтів з імунодефіцитом [10].

ПЛР дає змогу виявляти збудник у тканинах і органах, зокрема в печінці, – вірус може тривало перебувати в гепатоцитах без надходження у кров. Разом з тим, значення ПЛР не можна переоцінювати, цілком ймовірними є несправжньонегативні результати дослідження, зумовлені низькореплікативним типом інфекційного процесу.

Отже, розходження між результатами виявлення антитіл та ПЛР не завжди зумовлені хибно позитивним результатом ІФА або анамнестичним характером антитіл. Якщо у пацієнта тривалий час спостерігається стабільно високий рівень хоча б загальних anti-HCV, а тим паче антитіл до core антигену, необхідне динамічне спостереження за RNA HCV. Наведемо клінічне спостереження.

Хвора С., 11 р. Діагностовано хронічний ГС (виявлені anti-HCV загальні та anti-HCV IgM), генотип вірусу 1b, HCV RNA у концентрації 3 000 МО/мл. Активність АлАТ 5,0 ммоль/л, протеїногорама з помірними змінами. Загальний стан незначно порушений. Проведене лікування лафероном. Після закінчення 48-тижневого циклу терапії активність АлАТ нормалізувалася, результат ПЛР став негативним. Повторна перевірка методом ПЛР через 24 тижні – результат знову негативний, тобто отримана ніби стійка вірусологічна відповідь. Проте звертала на себе увагу висока концентрація загальних антитіл до вірусу (порівняно з обстеженням до лікування – зменшилась лише на 20 %). За результатами перевірки антитіл за допомогою тест-системи “ИФА АНТИ-HCV СПЕКТР” їхня специфічність підтвердилась. Моніторинг реплікації продовжили і ще через 12 тижнів була виявлена HCV RNA

У хворих, що пройшли курс противірусної терапії, вірус може тривалий час перебувати в печінці, або позапечінково, за відсутності HCV RNA у крові. Активація збудника призводить до появи HCV RNA у крові.

Низький рівень реплікації часто спостерігають у вагітних жінок та немовлят, що заразилися ГС антенатально або перинатально. У таких ситуаціях важливе значення також має моніторинг антитіл: тривале збереження їхньої концентрації або її поступове збільшення вказує на доцільність проведення повторних ПЛР.

У цілому наявність антитіл корелює з виявленням вірусної РНК, але є ситуації, коли неповний спектр антитіл не виключає активний інфекційний процес. Звичайно таке спостерігають на тлі імунодефіциту, зокрема в онкологічних хворих, у хворих з термінальною стадією ниркової недостатності, що перебувають на програмному гемодіалізі, у ВІЛ-інфікованих пацієнтів та ін.

Для ілюстрації цього положення наводимо результати обстеження хворих на програмному гемодіалізі.

Таблиця 2. Спектр антитіл до структурних та неструктурних антигенів HCV у хворих на програмному гемодіалізі.

ВиявленоHCV RNA

(число хворих)

у тому числі з антитілами до антигенів HCV

тільки core

core,

NS3

core,

NS4

core,

NS3,

NS4

core,

NS3,

NS4,

NS5

NS3,

NS4,

NS5

NS3,

NS4

тільки NS3

25

8

32%

2

8%

2

8%

2

8%

4

16%

3

12%

3

12%

1

4%

З наведених у таблиці 2 даних видно, що у цьому контингенті повний спектр антитіл до антигенів збудника виявлено лише в чотирьох хворих (16 %). Проте звертає на себе увагу, що навіть на тлі імунодефіциту в хворих на ГС переважають антитіла до core антигену: вони зустрічаються в різних комбінаціях у 18 хворих (72 %) із 25.

У значної частини хворих із вторинним імунодефицитом спостерігають наявність лише одного–двох видів антитіл, що загалом є нетиповим для хворих з активним інфекційним процесом. У таких випадках лише визначення вірусної РНК може вирішити сумніви щодо наявності в хворого ГС.

Через високий ризик інфікування HCV у відділенні гемодіалізу частина хворих обстежувалась раніше (упродовж 6–12 місяців). Серед них виявлено 4 пацієнти (33,3 %), в яких під час попереднього обстеження маркерів вірусного гепатиту не було. На момент даного обстеження усі вони мали антитіла до білка NS3, два у комбінації з core антитілами (один з них мав також anti-NS4). Це підтверджує припущення, що анти-NS3 мають самостійне значення для діагностики ГС і з’являються вже у гострій фазі хвороби, в той час як anti-NS4 ймовірно свідчать про більшу тривалість хвороби.

Можливість специфічної діагностики гострого ГС. Діагностика гострого гепатиту С є складною і практично не вирішеною проблемою, адже у більшості пацієнтів хвороба перебігає майже безсимптомно. Зазвичай такі хворі скаржаться лише на загальну слабість та зниження апетиту. У частини з них активність АлАТ у межах норми, що значно ускладнює діагностику. Діагноз ГС у цей період можна встановити лише шляхом виявлення RNA HCV, але таке обстеження проводять у випадку підозри на ГС (частіше з урахуванням епідеміологічних критеріїв).

Лише у незначної частини хворих гострий ГС супроводжується жовтяницею та високим рівнем активності АлАТ, але і в цьому випадку не завжди вдається виключити загострення хронічного процесу. Часто не допомагає і врахування морфологічних змін у печінці: у хворих на гострий ГС, навіть без клінічних проявів, спостерігають виражені зміни у паренхімі печінки – запальні інфільтрати, некротичні зміни на тлі початкових явищ фіброзу [11]. Саме тому їх тяжко відрізнити від хворих на хронічний ГС.

Важливе значення у таких випадках має відсутність або неповний спектр антитіл до антигенів збудника та їхня динаміка. Отже визначення спектру антитіл і спостереження за динамікою сероконверсії у хворих із наявністю в крові вірусної РНК може сприяти розмежування гострого та хронічного ГС. Проте наведені у таблиці 2 дані переконують, що у хворих з імунодефіцитом часто спостерігають неповний набір антитіл, навіть за тривалого хронічного процесу.

Справу ускладнює й те, що на відміну від багатьох інших захворювань, зокрема гепатиту В, наявність антитіл, що належать до імуноглобулінів класу М, не є свідченням гострого ГС: такі антитіла зустрічаються у хворих з реплікацією RNA HCV, незалежно від тривалості хвороби.

Перспективнішим є визначення авідності антитіл. Вважають, що співвідношення антитіл різної авідності вказує на тривалість процесу. Так, згідно інструкції до тест-системи “ДС-ИФА-АНТИ-HCV-АВИДНОСТЬ” НВО «Диагностические системы», якщо індекс авідності досліджуваної сироватки менше ніж 37 %, то сироватка містить низькоавідні антитіла – це вказує на первинну інфекцію. У літературі є дані про те, що врахування індексу авідності дозволяє уточнити стадію процесу, навіть відрізнити гострий процес від загострення хронічного, діагностувати паст-інфекцію. Питання це потребує подальшого вивчення.

Отже, сучасні методи специфічної діагностики лише частково вирішують проблему розмежування гострого та хронічного ГС. Проблема потребує подальшого вивчення.

ЛІТЕРАТУРА

  1. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты. (Эпидемиология, диагностика, профилактика). – М.: ГОУ ВУНМЦ. МЗ. РФ, 2003. – 384 c.
  2. Волчкова Е.В., Алленов М.Н. Острый гепатит С : клиническая картина и діагностика // Гепатологический форум – 2006. – №1. – С. 10-16.
  3. Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей / Пер. с англ. – М.: Геотар Медицина, 1999. – 859 с.
  4. Кузина Л.Е., Литвиненко М.О., Садикова Н.В и др. Роль иммуноблоттинга в качестве подтверждающего теста при определении анти-ВГС. VI Всероссийская научно–практическая конференция // «Вирусные гепатиты – проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики». Тезисы докладов. М., – 2005. – С. 166 – 167.
  5. Вирусный гепатит: информационные материалы. Нижний Новгород: НПО «Диагностические системы», – 2003. – 47 с.
  6. Гриза П.В. Гемотрансмісивна передача гепатитів В та С: проблеми та шляхи вирішення // Гепатологія. – 2009. – № 1. – С. 76-83.
  7. Перехрестенко П.М., Назарчук Л.В., Ларычева Н.І. Діяльність закладів служби крові України в 2007 р. // Довідник. – К. – 2008. – С. 3–72
  8. Корочкина О.В., Бузина А.Б. Прогностическое значение динамики антительного ответа на HCV в оценке эффективности противовирусной терапии больных хроническим гепатитом С// Мир вирусных гепатитов. – 2005. – № 2. – С.2–3.
  9. Герасун Б.А., Грицко Р.Ю., Ворожбит О.Б., Герасун О.Б. Вірусні гепатити у схемах, таблицях і малюнках// Львів: Ліга-прес, – 2008. – 95 с.
  10. Ильина Е.Н., Говорун В.М., Иваников И.О. Некоторые аспекты лабораторной диагностики вирусных гепатитов В и С // Терапевтический архив. – 2003.–№4. – С.84–86.
  11. Hoofnagle J.H. Hepatitis C: the clinical spectrum of disease // Hepatology. – 1997. – 26 (Suppl. 1). – P. 15–20.