Лабораторна діагностика. – 2008. – № 2. – С. 25–28.
Секреція цитокінів активованими лімфоцитами, моноцитами, макрофагами відіграє провідну роль у регуляції імунної відповіді. Збудники інфекційних хвороб та їх токсини сприяють секреції різних цитокінів та інших біологічних речовин, які беруть участь у посиленні специфічної і неспецифічної резистентності [4].
Можливість синтезу цитокінів у системі in vitro, що стимульована антигеном, має важливе значення для вивчення їх секреції, залежно від характеру антигену, інтенсивності та тривалості антигенної стимуляції. До того ж вміст цитокінів у супернатанті активованих антигеном мононуклеарних клітин певною мірою характеризує рівень сенсибілізації, у той час як активація мітогенами (лектинами) характеризує функціональний стан клітин та їх потенційну здатність до продукції цитокінів. Перевага мітогенів полягає в тому, що вони активують більшу частину лімфоцитів. Кількість антигензв’язуючих клітин не перевищує 1:10 000 частку усіх присутніх лімфоцитів, одначе, якщо ми хочемо вивчати вплив антигену, то повинні користуватися прямими методами [8; 9]
У даному повідомленні представлено метод вивчення специфічної реактивності імуноцитів, що активовані антигеном, за синтезом фактору некрозу пухлин альфа (ФНП-а) та гамма-інтерферону (g-ІФН) у культурі лейкоцитів (КЛ), виділених із периферичної крові хворих на хронічний гепатит В (ХГВ), Лайм-артрит та хронічний токсоплазмоз із вегетосудиною дистонією.
Метод є достатньо складним, бо на його результати можуть впливати різноманітні фактори, починаючи зі складу культурального середовища, режиму культивування та, в першу чергу, особливостей антигену. У деяких дослідженнях для виготовлення культури лейкоцитів використовують кров, розведену культуральною сумішшю [7], що на нашу думку є недоцільним, бо створює певний цитокіновий фон. До того ж присутність у КЛ еритроцитів, які мають здатність до сорбції антигенів, що містяться в крові, унеможливлює контрольне дослідження з неактивованими лейкоцитами. Це може спотворювати результати дослідження, особливо коли стимулюючий вплив антигену є незначним.
Важливе значення має відповідність дози антигену ступеню специфічної реактивності, бо надлишок антигенного стимулу призводить до суттєвого зменшення ефекту стимуляції. У наших спостереженнях ми зіштовхувалися з тим, що одна й та ж сама кількість антигену по-різному «працює» у ніби однотипних досліджуваних взірцях, а це створює проблему індивідуального (для кожного хворого) підбору «дози», що збільшує витрати антигену і ускладнює аналіз. Саме тому ми рекомендуємо використання антигену на твердій фазі, що робить результати стабільними і краще відтворюваними, а також усуває потребу у підборі дози антигену. Надмірна кількість антигену при цьому малоймовірна, а В-лімфоцити значно краще реагують на антигени на твердій фазі. Раніше ми вже повідомляли про доцільність використання антигену на твердій фазі у дослідах з визначення специфічної реактивності імуноцитів у реакції гальмування міграції лейкоцитів [1; 2]. Пізніше розроблено метод визначення специфічної реактивності імуноцитів за синтезом біологічно активних речовину у культурі лейкоцитів, стимульованих антигеном на твердій фазі [3].
Матеріали і методи
Для стимуляції клітин-продуцентів ФНП-a та g-ІФН використовували рекомбінантні антигени. При ХВГ – препарат HBcAg, наданий науково-виробничим об’єднанням «Диагностические системы» (м. Н.Новгород, Росія). Вміст білку в препараті становить 1мг/мл, автентичність та ступінь чистоти, визначена методом вертикального електрофорезу в SDS-поліакриламідному гелі, – до 90% від загального білку. Антиген додавали у ряд культуральних флаконів у кількості від 1 до 5 мкг/мл середовища. Врахували вищий результат. Паралельно аналогічне дослідження робили в спеціальних полістирольних планшетах з сорбованим антигеном.
У роботі з лейкоцитами від хворих на токсоплазмоз та бореліоз використовували лише антигени на твердій фазі полістеролу, бо у попередніх дослідженнях було встановлено інтенсивніше реагування імуноцитів на фіксовані антигени [3]. Використовували рекомбінантні антигени борелій на твердій фазі виробництва науково-виробничої фірми «Omnix» (СПБ, Росія), а також антигени на твердій фазі токсоплазм виробництва ЗАТ “Вектор-Бест” (Новосибірськ, Росія).
Культивування лейкоцитів здійснювали у присутності антигену.
Хід дослідження
Лейкоцити виділяють з гепаринізованої венозної крові (4000 од на 20 мл крові) шляхом відстоювання у силіконових пробірках під кутом 45º. Лейкоцитарну завись обережно відсмоктують і двічі відмивають не менше ніж у п’ятикратному об’ємі охолодженого розчину Хенкса, центрифугуючи при 400 g протягом 5 хвилин. Осад ресуспензують у середовищі № 199 з ембріональною бичачою сироваткою і доводять до концентрації 4–5106 клітин/мл середовища.
Культуральне середовище з лейкоцитами переносять до флаконів з відповідним антигеном (антиген на твердій фазі попередньо тричі відмивають стерильним 0,9% розчином NaCl по 40 c). Культивування здійснюють у атмосфері СО2 при температурі 37ºС протягом 48–72 годин. Для забезпечення нормального газообміну об’єм газу в культуральному флаконі перевищує об’єм середовища у 8–10 разів. Всі маніпуляції здійснюють стерильно, бажано у ламінарній шафі (боксі). За необхідності до культурального середовища можна додати стрептоміцин та пеніцилін з розрахунку по 100 од/мл, але це може дещо посилити неспецифічну стимуляцію лейкоцитів.
Вміст ФНП-a та g-ІФН у супернатанті стимульованих клітин визначається методом імуноферментного аналізу. Використовували тест-системи для наукових досліджень виробництва ТзОВ «Протеиновый контур», що дозволяють кількісно визначати ФНП-a та g-ІФН у крові та культуральній рідині.
У якості контролю дослідження використовували не стимульовані антигеном лейкоцити та лейкоцити здорових донорів, які не мали (за даними ІФА) антитіл до відповідних антигенів. Перед початком культивуванням визначали вміст ФНП-a та g-ІФН у надосадовій рідині (фон). Результати дослідження зіставляли із вмістом ФНП-a та g-ІФН у периферичній крові донорів лейкоцитів.
Результати та їх обговорення
У всіх досліджуваних взірцях лейкоцитів від хворих на хронічний гепатит В (ХГВ) зареєстровано синтез g-ІФН та ФНП-a, про що свідчить виявлення їх у кількості понад 50 пг/мл, за відсутності до початку культивування та у супернатанті нестимульованих клітин (чутливість використаних тест-систем – починаючи з 50 пг/мл). Необхідно, одначе, відмітити, що в одному випадку з лейкоцитами донора, у периферичній крові якого не виявлено анти-НВs та анти-НВс, відбувся інтенсивний синтез ФНП-a (1200 пг/мл). Донор цей багато років працює із матеріалом від хворих на гепатит В (один із авторів даного повідомлення) і тому можна думати про своєрідну форму імунного реагування.
Синтез ФНП-a та g-ІФН у досліджуваних взірцях коливався у широкому діапазоні. Розглянемо це на прикладі хронічного гепатиту В (таблиця 1).
Як видно із даних, наведених у таблиці 1, синтез у КЛ з крові хворих на ХГВ коливався у широкому діапазоні. У двох спостереженнях вміст ФНП-a сягав понад 1000 пг/мл: в одного з пацієнтів в час обстеження спостерігалось тяжке загострення хвороби, а другий, навпаки, звільнився від антигену і в нього припинилася реплікація DNA HBV.
У хворих на НВеAg-негативний ХГВ середні показники синтезу ФНП-a були нижчими, ніж у пацієнтів із НВеAg-позитивним ХГВ.
Особливості синтезу ФНП-a та g-ІФН у досліджуваних взірцях виявилися подібними. Це відповідає сучасним уявленням про їх взаємодію в природних умовах [5], зокрема вважається, що ФНП-a разом із g-ІФН посилюють експресію молекул головного комплексу гістосумісності класу II на макрофагах [4].
Та головним результатом цього дослідження вважаємо те, що використання антигену на твердій фазі полістеролу виявилося ефективнішим. Особливо чітко це проявилося у дослідах з визначенням секреції g-ІФН у хворих на ХГВ: кількість досліджуваних взірців з високим (понад 300 пг/мл) вмістом інтерферону у супернатанті клітин була вірогідно вищою, а ніж при використані антигену у розчині (відповідно 36,8%, проти 7,9%; р<0,002)
Аналогічні дані одержані і у дослідах із антигенами борелій та токсоплазмозним антигеном. Синтез g-ІФН було зареєстровано в усіх досліджуваних взірцях з використанням в якості активатора лейкоцитів антигену на твердій фазі.
Дослідження з використанням комплексу рекомбінантних антигенів різних генотипів борелій на твердій фазі показало активний синтез ФНП-a у КЛ, виділених із крові хворих на Лайм-артрит (n=12), особливо у випадках резистентності до протимікробної терапії.
Що стосується токсоплазмозу, то згідно попередніх даних наявна тенденція до вищих показників специфічної реактивності імуноцитів у хворих на хронічні форми хвороби із високим вмістом антитіл до токсоплазм. Вірогідно частіше таке спостерігається у хворих з ураженням ЦНС (досліджено 13 КЛ).
У наше завдання не входив детальний аналіз особливостей клінічного перебігу інфекційних захворювань в залежності від синтезу ФНП-a і g-ІФН у культурі лейкоцитів. Йдеться лише про доцільність використання антигену на твердій фазі у якості індуктора синтетичних процесів у культурі лейкоцитів.
Важливо, що вміст визначених речовин у супернатанті культивованих лейкоцитів не корелював із їх вмістом у периферичній крові. Це дозволяє зробити обґрунтований, на нашу думку, висновок, що секреція у стимульованій антигеном КЛ залежить від рівня сенсибілізації клітин до певного антигену – саме такий механізм їх активації здається нам найімовірнішим.
Відомим методом вивчення сенсибілізації лімфоцитів є специфічна бласттрансформація лімфоцитів (БТЛ). Як відомо, цей метод дозволяє ідентифікувати активовані клітини за морфологічними змінами, що визначаються під світловим мікроскопом [8]. У наших спостереженнях в активованих антигеном культурах лімфоцитів відбувалася БТЛ, одначе між її кількісними показниками та синтезом ФНП-a і g-ІФН кореляції не було. Та цього недостатньо, щоб стверджувати, що між цими процесами немає зв’язку. По-перше, жодний стимулятор не активує всіх клітин, а спектр дії антигену є значно ширшим, ніж вплив на клітини, що піддаються трансформації у бласти [6], по-друге, неможна однозначно стверджувати, що синтез ФНП-a та g-ІФН є обов’язковим етапом БТЛ. Тим паче, якщо йдеться про різні антигени. Важливіше те, що запропонований метод визначення специфічної реактивності імуноцитів за синтезом цитокінів розширяє можливості вивчення механізмів специфічної активації імунокомпетентних клітин.
Висновки
- Кількісна оцінка синтезу ФНП-a та g-ІФН активованими лейкоцитами розширяє можливості вивчення специфічної реактивності імуноцитів і може використовуватись у наукових дослідженнях з вивчення імунопатогенезу інфекційних захворювань. Метод може також використовуватись і у клінічній практиці для встановлення специфічної реактивності імуноцитів та визначення особливостей імунопатології
- Використання антигену на твердій фазі підвищує ефективність дослідження і може бути корисним у тих випадках, коли антиген у розчині є недостатньо потужним стимулятором синтезу цитокінів.
Література
- Бурлев В.Л., Герасун Б.А., Титов В.М., Шевченко Л.Ю. Способ диагностики сенсибилизации организма к вирусу гепатита В // Авторское свидетельство СССР № 1193850, 22.02.1985 г.
- Герасун Б.А. Вірусний гепатит В. – Львів: Вільна Україна, 1993. – 178 с.
- Герасун О.Б., Задорожний А.М., Зінчук О.М. Спосіб визначення сенсибілізації організму при інфекційних хворобах // Патент на корисну модель № 26600, 25.09.2007 р.
- Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и алергология – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2003. – 604 с.
- Кетлинский С.А., Симбирцев А.С, Воробьев А.А. Эндогенные иммуностияторы / Санкт-Петербург: Гиппократ, 1992. – 256 с.
- Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Г. Лолора-младшего, Т. Фишера и Д. Адельмана. / Пер. с англ. – М.: Практика, 2000. – 806 с.
- Прилуцький О.С., Лєсніченко Д.О., Сергієнко А.С. Індукція окремих цитокінів та інтерферонів антигенами різних збудників // Лабораторна діагностика. – 2007. – № 3. – С. 24-27.
- Эшмен Р.Ф. Активация лимфоцитов / В кн.: Иммунология, т.1, под ред. У. Пола; перевод с англ. Иммунология в 3 т.. – М.: Мир, 1987. – 476 с.
- Якобисяк М. Імунологія / Пер з польської за ред. В.В.Чоп′як. – Вінниця: Нова книга, 2004. – 672 с.
Резюме
Б.А. Герасун, А.Н. Зинчук, А.М. Задорожный, А.Б. Герасун
К ВОПРОСУ ОБ ИССЛЕДОВАНИИ АНТИГЕННОЙ АКТИВАЦИИ ИММУНОЦИТОВ ПO ОЦЕНКЕ СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОКИНОВ В КУЛЬТУРЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
Предложен метод исследования антигенной стимуляции лейкоцитов исходя из секреции ФНП-a та g-ІФН в культуре лейкоцитов периферической крови, стимулированной антигеном на твердой фазе. Показано, что метод имеет преимущества перед принятым, так как освобождает от необходимости подбора оптимальной дозы антигена, к тому же антиген на твердой фазе может быть более мощным стимулятором синтеза цитокинов.
Summary
B.A.Gerasun, A.N.Zinchuk, A.M.Zadorozhny, A.B.Herasun
REGARDING ANTIGEN STIMULATION OF IMMUNOCYTES INVESTIGATIONS BY MEANS OF CYTOKINE TITRES IN PERIPHERAL LEUKOCYTE CULTURE
The author has suggested a method of detection of leukocytes antigen stimulation using a-TNF and g-INF secretion in leukocytes culture. Leukocytes were obtained from venous blood and then stimulated with antigen on a solid base. The method has been shown to have advantage over commonly used methods as detection of optimal antigen dose is no longer necessary, also an antigen on a solid base can prove to be a more potent stimulator of cytokines synthesis.