Кіселик І.О., Луцик М.Д., Шевченко Л.Ю. Особливості визначення нітратів та нітритів в периферичній крові у хворих на вірусні гепатити та при синдромі жовтяниці іншої етіології.

Лабораторна діагностика – 2001. – № 3. – С. 43-45

Оксид азоту, є одним із представників біорегуляторів системної дії, який приймає участь у багатьох фізіологічних та патофізіологічних процесах. Відмічено вплив NO на секреторну функцію тканин та клітин. Регуляторна дія NО у всіх цих системах забезпечується його генерацією із L-аргініну [1-2].

Цей процес являє собою комплексну окисну реакцію, що каталізується ферментом NO-синтетазою (NOS), який приєднує молекулярний кисень до кінцевого атома азоту в гуанідиновій групі L-аргініну [3].

Встановлено, що в гепатоцитах знаходиться і експресується ген індуцибельної NO-синтетази (iNOS) [4]. Ці клітини мають здатність продукувати значні кількості NO у відповідь на системне запалення [5], що супроводжується змінами в метаболічних процесах печінки, які найчастіше корелюють з активністю амінотрансфераз в плазмі або підтверджуються гістологічно.

Встановлено, що посилення синтезу NO стимулюється ліпополісахаридами (ЛПС) та інтерфероном-g (INF-g). При цьому спостерігається накопичення значної кількості NO – іонів NO^–₂ і NO^–₃ [4-6].

Останнім часом проводяться інтенсивні дослідження з метою вияснення ролі NO при системних ураженнях печінки. При цьому було виявлено як позитивні так і негативні ефекти NO. Існує припущення, що NO захищає печінку від пошкодження. Разом з тим, підвищення рівня NO спостерігається і при хронічних гепатитах, особливо вірусної етіології до того ж припускається, що NO може виступати і як канцероген [7-8].

До важливих факторів, що визначають роль NO при патологічних станах, слід віднести інтенсивність та тривалість його утворення. Експресія NO при гострому запаленні забезпечує максимальну перфузію тканин, здійснюючи тим самим захисний ефект [9]. Крім того NO пригнічує агрегацію тромбоцитів і тим самим попереджує гіперкоагуляцію, а також нейтралізує токсичну дію кисневих радикалів. Вважається, що при гострих порушеннях в печінці підвищення рівня iNOS в гепатоцитах має гепатопротекторний вплив [10].

Встановлено, що репродукція гепатотропних вірусів викликає значну активацію iNOS. Допускається, що існує зв’язок, між активністю iNOS та інтенсивністю інтерфероноутворення [11]. Не виключено існування зворотнього зв’язку.

В наших дослідженнях ми визначали рівень NO в крові та сироватці хворих на гострі та хронічні гепатити. Зважаючи на високий рівень білірубіну в крові, описані в літературі методики, були нами дещо модифіковані. З метою уникнення маскуючого впливу білірубіну на кольорову реакцію, при визначенні рівня NO в цільній крові ми застосували діаліз проти дистильованої води протягом 2 годин, з подальшим визначенням рівнів NO^–₂ та NO^–₃ в діалізаті. Відновлення нітратів до нітритів проводиться металічним цинком в оцтовокислому розчині. Іони NO^–₂ виявляють діазореакцією з реактивом Грісса, з наступним колориметричним визначенням азоз¢єднання рожево-червоного кольору. Реакція специфічна для нітритів, чутливість визначення – 40 мкг нітрат-іонів [12].

Таким чином методика визначення NO в крові хворих на гострі та хронічні гепатити полягає в наступному:

1. Прилади і посуд:
Хімічні пробірки, піпетки на 1, 5, 10, 20мл, мірні колби на 100мл, 1л, конічні колби, хімічні стакани, мішечки для діалізу, циліндри на 10, 50, 100мл, ФЕК.

2. Реактиви і розчини:
Сульфанілова к-та (х.ч.), a-нафтиламін (х.ч.), оцтова кислота, льодяна, (х.ч.), калій азотнокислий (х.ч.), цинковий пил, (х.ч.), марганець сірчанокислий (х.ч.).

3. Приготування реактиву Грісса:
а) 0,5г сульфанілової кислоти розчиняють в 150 мл 12% розчині оцтової кислоти;

б) 0,1г a-нафтиламіну розчиняють при нагріванні в 20 мл дистильованої води, фільтрують і змішують з 150 мл 12% розчину оцтової кислоти. Розчини зберігають окремо на холоді протягом 2-х місяців. Перед застосуванням одну частину розчину «а» змішують з рівною за об’ємом частиною розчину «б».

4. Приготування стандартного розчину нітрату калію:
Розчиняють 1,630 г. нітрату калію, висушеного до постійної ваги при 105°, в дистильованій воді в мірній колбі об’ємом 1л. і доводять об’єм розчину до мітки дистильованою водою. 1мл. цього розчину містить 1 мг. нітрат іону (NO^–₃). Розчин можна зберігати в холодильнику на протягом 3 місяців.

5. Приготування робочого розчину нітрату калію:
В мірну колбу об’ємом 100 мл переносять піпеткою 20 мл стандартного розчину нітрату калію і доводять об’єм розчину в колбі до мітки дистильованою водою. Один мл цього розчину містить 0,2 мг (200 мк) нітрат-іону NO₃. Розчин повинен бути свіжо приготовленим.

6. Хід визначення:
5 мл крові взятої натще, поміщають в мішечки для діалізу і діалізують проти 20мл дистильованої води протягом 2 годин. Об’єм діалізату заміряють і відбирають аліквоту 6 мл. для аналізу.

В пробірку з 6 мл діалізату, що аналізується додають 2 мл 10% оцтової кислоти і вносять на кінчику скальпеля (не більше 30мг) суміші цинкового пилу з сірчанокислим марганцем (1г цинкового пилу попередньо змішують з 100 г сірчанокислого марганцю). Пробірку струшують 0,5 хв. Потім в пробірку додають 1 мл реактиву Грісса, перемішують вміст пробірки і через 10 хв. колориметрують розчин на спектрофотометрі, при довжині хвилі 538 нм, в кюветах 10 мм, розчин для порівняння – дистильована вода.

7. Побудова стандартної кривої:
У 8 пробірок вносять робочий розчин стандарту КNO₃ в кількостях, вказаних в таблиці 1.

Таблиця 1. Побудова калібровочної кривої.

Об’єм в пробірках доводять до 6 мл дистильованою водою, додають в кожну пробірку по 2 мл 5% оцтової кислоти і вносять на кінчику скальпеля (не більше 30 мг.) цинкового порошку з сірчанокислим марганцем. Далі проводять всі операції як описано для дослідних пробірок.

Визначають оптичну щільність розчину в пробірках, і будують калібровочну криву.

Розрахунок роблять за формулою:

Х=V₁xСx1000,  де
V₂xА

Х – концентрація нітритів (нітрит-іона), в мг/кг.
С – кількість нітрат-іону, знайдений за калібровочною кривою, в мг.
А – об’єм проби крові (мл).
V₁ – загальний об’єм фільтрату (мл).
V₂ – об’єм фільтрату, який взято для аналізу (мл).

При необхідності перерахунку на концентрацію нітрату калію, кількість нітрат іонів потрібно помножити на перерахунковий коефіцієнт 1,6; таким чином ми визначимо кількість нітрату калію (мг/кг).

Методика дає можливість визначати в одній і тій самій пробі нітрати і нітрити. Приготування проб для аналізу в обох випадках аналогічне.

З одного і того ж фільтрату або діалізату відбирають аліквотну частину для аналізу на нітрити (10мл) і нітрати (6мг). Подальше визначення нітритів проводять за методикою описаною вище. Для того, щоб визначити окремо вміст нітрат-іонів із суми нітрат- і нітрит-іонів, необхідно з неї відняти кількість нітрит-іонів, визначеною за описаною методикою. При цьому роблять розрахунок кількості нітрит-іонів в відповідну кількість нітрат-іонів, використовуючи коефіцієнт 1,3. Вихідний розрахунок нітрат-іонів проводять за формулою:

Х= С₁-С₂x1,3, де :

Х- Кількість нітрат іонів в аналізованому взірці, у мг/кг або мг/л.
С₁ – сума іонів NO^–₃ та NO^–₂, у мг/кг.
С₂ – кількість нітрит-іонів, NO^–₂, у мг/кг.
1,3 – коефіцієнт перерахунку нітрит-іонів в нітрат-іони.

Методика визначення NO₂ в сироватці крові.

Кров для досліджень в об’ємі 2-3 мл. беруть ранком натще. Сироватку отримують стандартним методом. Для осадження білків до 1 мл сироватки додають 1 мл 0,12М розчину NaOH, 4 мл розчину сульфату цинку 5,4 г/л і нагрівають 6 хв. на водяній бані при 100°С. Після охолодження фільтрують через обеззолений паперовий фільтр, беруть 900 мкл фільтрату, додають 100 мкл 3М водного аміаку, 200 мкл 0,1М розчину соляної кислоти. Потім додають 1,8 мл. реактиву Грісса (див. вище “приготування реактиву”).Через 15 хв. вимірюють інтенсивність забарвлення на спектрофотометрі при довжині хвилі 538 нм. (зелений фільтр). Паралельно з дослідженням сироваток кожен раз проводять замір двох контролів (вода для ін’єкцій та стандартний розчин –фіксанал 1мкг/мл нітриту). Масову концентрацію нітриту в мікрограмах на 1 мл. вираховують за формулою:

Х=12(С_х – С_о),

де С_х – масова концентрація нітриту, знайдена по стандартній кривій.
С_о – масова концентрація нітриту в холостій пробі.
Реактиви для досліджень марки х.ч. або ч.д.а [13].

Наші дослідження показали, що рівні NO^–₂ та NO^–₃ у здорових (донори крові) не перевищують 4,0+1,0 та 8,0+2,0 мг/%, що умовно можна прийняти за нормальний рівень.

Запропонована методика визначення нітритів та нітратів в крові хворих із значною гіпербілірубінемією має особливе значення при обстеженні хворих з гострими та хронічними печінковими жовтяницями, в першу чергу вірусної етіології.

Отримані нами результати свідчать, що рівень NO^–₂ та NO^–₃ як в сироватці крові так і в цільній крові є вищим у хворих на гострі та хронічні вірусні гепатити різної етіології, ніж у контрольної групи (донори крові). Наші попередні результати свідчать про кореляцію між тяжкістю процесу, гострим чи хронічним, і в якійсь мірі етіологією гепатиту.

Список літератури

1. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований // Биохимия. – 1998. – Т.63, вып. 7. – С. 867 – 869.
2. Гуревич К.Г., Шимановский Н.Л. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функции // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. – 2000. – №4. – С. 16 – 21.
3. Тейлор Б.С., Аларсон Л.Х., Биллиар Т.Р. Индуцибельная синтаза оксида азота в печени: регуляция и функции // Биохимия. – 1998. – Т.63, вып. 6. – С. 905 – 923.
4. Salvemini D., Misko T.P., Masferrer J.L. et al. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1993. – Vol. 90. – P. 7240 – 7244.
5. Хаценко О.О. Взаимодействие оксида азота и цитохрома Р-450 в печени // Биохимия. – 1998. – Т.63, вып. 6. – С. 984 – 991.
6. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислотные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия . – 1998.  – Т.63, вып. 7. – С. 1007 – 1019.
7. Sharara A.I., Perkins D.J., Misukonis M.A. et al. Interferon (IFN)-alpha activation of human blood mononuclear cells in vitro and in vivo for nitric oxide synthase (NOS) type 2 mRNA and protein expression: possible relationship of induced NOS2 to the anti-hepatitis C effects of IFN-alpha in vivo //J. Exp. Med. – 1997. – Vol. 9, № 3. – P. 1495 – 1502.
8. Проскуряков С.Я., Бикетов С.И., Иванников А.И., Скворцов В.Г. Оксид азота в механизмах патогенеза внутриклеточных инфекций // Иммунология. – 2000. – №4. – С. 9 – 20.
9. Малышев И.Ю. Введение в биохимию оксида азота. Роль оксида азота в регуляции основных систем организма // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 1997. – №1. – С. 49 – 55.
10. Ochoa J.B., Billiar T.R., Peitzman A.R. The role of nitric oxide in hemorrhagic shock and trauma //Shock, Sepsis and organ Failure Nitric Oxide / Eds: G. Schag, H. Redl. – Berlin, Heidelberg: Springer – Verlag, 1995. – P. 84 – 101.
11. Schweyer S., Mihm S., Radzun HJ. et al. Liver infiltrating T lymphocytes express interferon gamma and inducible nitric oxide synthase in chronic hepatitis C virus infection //J. Gut. – 2000. – Vol. 46, №2. – P. 255 – 259.
12. Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и др. Клиническая и лабораторная диагностика в ветеринарии // Morde, Агропромиздат. – 1985. – 87 с.
13. Карпюк В.Б., Черняк Ю.С., Шубич М.Г. Лабораторный мониторинг состояния нитроксидергической вазорелаксации при субарахноидальном кровоизлиянии //Клиническая лабораторная диагностика. – 2000. – №5. – С. 16 – 18.