Герасун О.Б. Особливості імунопатогенезу хронічного гепатиту В з інверсією HbeAg.

Гепатологія – 2009. – № 1 – С. 59–65.

Вступ. Сучасні уявлення про патогенез гепатиту В грунтуються на тому, що організація геному HBV дає змогу вірусу потрапляти до клітини-хазяїна та відтворювати запрограмовані процеси паралельно з процесами життєдіяльності в інфікованій клітині. Розмноження збудника і вихід з клітини не супроводжується ураженням гепатоциту, HBV не є цитотоксичним [1–3]. Загально визнано, що запально-некротичні процеси, хоч ініційовані реплікацією збудника, безпосередньо з нею не зв’язані і відбуваються за участі ефекторноклітинних та клітинно-гуморальних механізмів у відповідь на експресію антигенів HBV. Клінічно виражені прояви гепатиту зумовлені експресією на поверхні клітин HBcAg та HBeAg, які виступають як головні мішені імунної відповіді.

Відсутність кореляції між вірусним навантаженням і вираженістю патоморфологічних проявів та прямий зв’язок з інтенсивністю імунної відповіді на антигени HBV підтверджують, що гепатит В є хворобою імунної відповіді. Доведено, що антигени збудника (в першу чергу HBcAg та HBeAg) індукують деструктивні реакції клітинного та гуморального імунітету [4]. Провідним механізмом ураження гепатоцитів є імунний апоптоз, який відбувається переважно в наслідок клітинного імунітету, в першу чергу за участю цитотоксичних Т-лімфоцитів.

Ці традиційні підходи до тлумачення патогенезу гепатиту В, як стало відомо в останні роки, переважно стосуються процесів, що пов’язані із диким штамом HBV [1]. Але у хворих на хронічний гепатит В (ХГВ) досить часто відбувається мутація pre-core та core гена HBV, які призводять до утворення трансляційного стоп-кодону з припиненням експресії pre-С/С протеїну – попередника синтезу HBeAg [4 – 5].

Дані про роль індукованої антигеном імунної відповіді у патогенезі гепатиту В вказують на те, що мутації, наслідком яких є припинення синтезу HBeAg, повинні суттєво впливати на перебіг інфекційного процесу. Це припущення дістало підтвердження. Встановлено, що інверсія HBeAg у хворих на ХГВ із реплікацією HBV призводить до толерантності і зменшення інтенсивності імунного апоптозу зі сповільненням кліренсу HBV [6–9]. Проте залишається дискусійним питання про те, яким чином інверсія HBeAg сприяє розвитку толерантності до HBV у хворих з експресією HBcAg, що розглядається як потужніший антиген вірусу (антитіла до нього з’являються раніше, ніж HBeAb).

Вирішення цього питання було метою нашого дослідження.

Матеріали та методи дослідження. Для вивчення впливу інверсії HBeAg на сенсибілізацію лімфоцитів до антигенів HBV обстежували хворих на ХГВ в різні терміни після припинення синтезу е-антигена. Обстежено 44 хворих на HBeAg-негативний ХГВ із реплікацією HBV DNA. Для встановлення НВеАg-негативності е-антиген у хворих з реплікативною формою ХГВ визначали не менше 2-х разів протягом шести місяців. Для підтвердження інверсії HBeAg визначали anti-НВе.

Виходячи з того, що відсутність або низький не ідентифікований рівень НВеАg може зумовити інтеркуренція з іншими вірусами, у групу дослідження увійшли пацієнти, в яких виключено дельта-інфекцію, гепатит С, ВІЛ-інфекцію та цитомегаловірусну інфекцію.

Маркери вірусних гепатитів визначали методом ІФА з використанням тест-систем III-IV покоління, переважно НВО “Диагностические системы”, м.Н.Новгород (Росія) та “Вектор-Бест”, м. Новосибірськ (Росія) в комплектації з ТМБ. У разі відсутності HBeAg, сироватки крові додатково перевіряли за допомогою тест-системи “Сalbiotech, inc” (США, Калифорнія).

У всіх хворих з відсутністю НВеАg визначали НВV DNA методом ПЛР.

Особливості імунної відповіді на антигени HBV у хворих з інверсією HBeAg вивчали досліджуючи специфічну реактивність імуноцитів у культурі лейкоцитів периферичної крові (КЛ). Зазвичай у подібних дослідженнях визначають інтенсивність бласттрансформації під впливом антигенної стимуляції лейкоцитів. Проте, на нашу думку, певні переваги має визначення вмісту цитокінів у супернатанті сенсибілізованих лімфоцитів. Справа в тому, що морфологічні зміни лімфоцита – клітини, яка під впливом рослинного мітогена або антигенного стимулятора трансформації перетворюється на свого попередника бласта – є заключним етапом складного процесу, який починається з активізація генома та стимуляції клітинного обміну. Саме тому синтез цитокінів відбувається значно раніше, до того ж його вміст зростає навіть в умовах незавершеної БТЛ. Останнє пов’язано з вірусним ушкодженням хромосомного апарату клітини, бо лейкоцити є мішенню для HBV.

Принцип методу. В основі методу лежить здатність сенсибілізованих лімфоцитів під впливом антигена, до якого клітини сенсибілізовані, піддаватись трансформації, під час якої відбувається синтез гамма-інтерферону (-ІФН) та фактору некрозу пухлин альфа (ФНП). Синтез цитокинів у стимульованій антигеном КЛ є одним з показників підвищеної чутливості сповільненого типу (ПЧСТ) [10,11].

Хід дослідження. Культивування лейкоцитів периферичної крові хворих на ХГВ. Культивування лейкоцитів периферичної крові хворих на ХГВ проводили на середовищі №199. Плазму із лейкоцитами розводили середовищем так, щоб в 1 мм3 завісини містилось 1-2×106 клітин/мл. Для забезпечення нормального газообміну обсяг газового середовища перевищував обсяг середовища у 8-10 разів.

В якості специфічного стимулятора трансформації сенсибілізованих клітин використовували рекомбінантні HBсAg та HBeAg, виготовлені науково-виробничим об’єднанням “Диагностические системы” (Н.Новгород, Росія). Антигенний стимулятор додавали до культурального середовища у дозі від 0,01 до 0,1 мг білка на мл середовища.

Характеристика використаних антигенів: продуцент антигенів – E-coli, вміст білка у препараті HBсAg становить 1,0 мг/мл, у препараті HBeAg – 3,7 мг/мл, автентичність та ступінь чистоти, визначена методом вертикального електрофорезу у SDS-поліакриламідному гелі, становила 90-95% від загального білку.

Облік результатів дослідження. Концентрацію γ-ІНФ та ФНП-α у супернатанті КЛ досліджували через 72 та 166 годин культивування. У досліджені використовували набори реагентів ProCon IFgamma та ProCon TNFα (ТзОВ «Протеиновый контур», м. Санкт-Петербург, Росія), призначені для визначення γ-ІНФ та ФНП-α у культуральній та технологічній рідині методом ІФА.

Використовували такі контролі: 1) лейкоцити у культуральному середовищі з HBeAg (або HBсAg), заморожені при -45ºС (у такому стані зберігалися до закінчення досліду); 2) лейкоцити, які культивували без антигена та інших стимуляторів трансформації.

Вміст цитокінів у КЛ із некультивованими лейкоцитами приймали за їх вихідний рівень. Результат враховували за умови відсутності синтезу цитокинів у нестимульованій антигеном КЛ.

Результати дослідження та їх обговорення. У процесі дослідження дістало підтвердження, що у КЛ периферичної крові хворих на ХГВ під впливом HBcAg та HBeAg відбувається синтез ФНП-α та γ-ІНФ, тобто антигени виступають у ролі індуктора синтезу цитокинів попередньо сенсибілізованими клітинами. Вміст цих цитокінів у супернатанті короткочасної культури лейкоцитів характеризує трансформуючий вплив антигенів і відповідно рівень сенсибілізації імуноцитів до антигенів HBV. Наявність γ-ІНФ та ФНП-α у супернатанті КЛ, стимульованих HBcAg або HBeAg, дає змогу припустити, що в природних умовах відбувається їх кооперативна взаємодія у забезпечені імунологічного гомеостазу.

У культурах лейкоцитів, не стимульованих антигеном (контрольні досліди), ФНПα та γ-ІНФ не синтезувались, хоча в них відбувалася проліферація сегментоядерних клітин із утворенням макрофагів, тобто лише трансформація лімфоцитів супроводжується синтезом досліджених цитокінів.

Оскільки продукція цитокінів у КЛ може бути пов’язана із впливом мітогенного фактору (не обов’язково специфічного вірусного) ми не можемо впевнено говорити про вірусіндукованість синтетичних процесів. Але їх інтенсивність характеризує рівень специфічної реактивності лімфоцитів до антигенів HBV, бо саме вони виступають у нашому досліджені як специфічні мітогені фактори.

Синтез γ-ІНФ у КЛ, стимульованих антигеном, коливався у широкому діапазоні. Продукція цитокінів була інтенсивнішою у КЛ, стимульованих HBcAg. Так, вміст ФНП-α, вищий за 300 пг/мл, зареєстрований у 16 із 44 КЛ (36,4%), що стимульовані HBcAg. Синтез такої інтенсивності під впливом HBeAg зареєстровано лише в 5 КЛ (11,4%). На підставі цих даних можна дійти висновку, що сенсибілізація до HBcAg у КЛ, є сильнішою, ніж до HBeAg. У всякому разі таке встановлене для HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного ХГВ.

Важливо, що рівень синтетичної активності культивованих лейкоцитів, хоч і коливався у широкому діапазоні, не залежав від вмісту цитокінів у периферичній крові хворих – донорів лейкоцитів. Наприклад, у КЛ №9 концентрація ФНП-α під впливом HBcAg на третій день культивування становила 220 пг/мл (у сироватці крові донора лейкоцитів – 50 пг/мл.), натомість у КЛ № 30 вміст ФНП-α під впливом HBcAg на третій день культивування досяг 849 пг/мл, хоч його вміст у сироватці крові донора лейкоцитів був суттєво меншим (20 пг/мл).Тому видається ймовірним, що результати досліджень in vitro характеризують потенційну здатність клітин до синтезу цитокінів. Таке припущення має реальні підстави. Так, у досліді з лейкоцитами хворої на ХГВ, яка повністю одужала і звільнилась від HBsAg, інтенсивна продукція ФНП-α у КЛ, простимульованій HBeAg, була зареєстрована ще до завершення інфекційного процесу, раніше ніж відбулось підвищення вмісту ФНП-α у сироватці крові. Після видужання вміст ФНП-α у сироватці крові вже через п’ять місяців знизився до 50 пг/мл, але в культурі лейкоцитів клітини продовжували інтенсивно реагувати на HBeAg, ймовірно через збереження імунологічної пам’яті.

У наших дослідженнях низькі показники синтезу γ-ІНФ (від 0 до 50 пг/мл) переважно були зареєстровані у КЛ з крові хворих на HBeAg-негативний ХГВ зі значною тривалістю інверсії. Це підтверджувало доцільність вивчення особливостей ПЧСТ до антигенів HBV у різні терміни інверсії HBeAg.

На жаль, ми не завжди могли встановити конкретний термін інверсії HBeAg в anti-HBe, одначе у частини з тих хворих, які знаходились під нашим спостереженням, вдавалося зареєструвати факт припинення синтезу HBeAg з приблизною похибкою в 30-60 днів (якщо в час попереднього обстеження HBeAg було виявлено); в інших випадках на відносно нещодавнє припинення синтезу HBeAg вказувала відсутність HBeAb (фаза імунологічного вікна). З появою антитіл інверсія діставала підтвердження. До того ж з’являлася можливість орієнтовно встановити час інверсії, виходячи з того, що антитіла з’являються не пізніше, ніж через шість місяців від зникнення HBeAg (частіше через 2–3 місяці). Частина хворих мала результати лабораторних обстежень за минулі роки, з яких нам було відомо, що HBeAg в них відсутній протягом тривалого часу.

На підставі цих даних ми і проаналізували динаміку показників специфічної реактивності до HBeAg у хворих на HBeAg-негативний ХГВ. (табл. 1).

Таблиця 1. Динаміка показників сенсибілізації до HBeAg у хворих на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ.

Час від інверсії HBeAg	Синтез цитокінів у КЛ, стимульованій HBeAg (пг/мл)
	γ-ІНФ	ФНП-α
6–12 місяців	174 ± 15,2	234 ± 11,8
1–3 роки	80 ± 9,6	165 ± 12,5
4–5 років	56,8 ± 4,3	78,5 ± 6,6
> 5 років	27 ± 5,4	32,9 ± 3,3

З наведених у табл. 1 даних видно, що сенсибілізація до HBeAg у хворих з інверсією HBeAg швидко зменшувалась Так, у культурах лейкоцитів, виділених з периферичної крові хворих пацієнтів через 6 –12 місяців після інверсії HBeAg, синтез γ-ІНФ та ФНП-α під впливом HBeAg в середньому становив 174 та 234 пг/мл відповідно. Проте з часом рівень специфічної реактивності імуноцитів зменшувався: вже через 1– 3 роки продукція γ-ІНФ скоротилася більше ніж на половину, а після 5-ти років з часу інверсії вміст цитокіну у супернатанті стимульованої антигеном КЛ не перевищував 27,5 пг/мл. З часом зменшувався й синтез ФНП-α.

Результати дослідження свідчать, що інверсія HBeAg супроводжується розвитком толерантності до антигену.

При аналогічному дослідженні особливостей сенсибілізації до HBсAg встановлено, що вона має багато спільного з ПЧСТ до HBeAg – динаміка показників специфічної реактивності імуноцитів до обох антигенів HBV виявилась однотипною (табл. 2), хоча темпи її згасання є дещо повільнішими.

Таблиця 2. Динаміка показників сенсибілізації до HBсAg у хворих на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ.

Час від інверсії HBeAg	Синтез цитокінів у КЛ, стимульованій HBсAg (пг/мл)
	γ-ІНФ	ФНП-α
6–12 місяців	193,5 ± 12,6	210,0 ± 21,2
1–3 роки	112 ± 11,4	143,3 ± 17,8
4–5 років	73,0 ± 8,6	88,0 ± 9,7
> 5 років	32,1 ± 2,3	38,8 ± 5,8

Результати визначення специфічної реактивності імуноцитів свідчать, що після інверсії HBeAg на HBeAb зменшується інтенсивність сенсибілізації не тільки до HBeAg, що цілком зрозуміло, але й до HBсAg.

Розвиток толерантності до HBV у хворих з інверсією HBeAg, що відбувається попри збереження експресії HBcAg, звичайно пояснюють зменшенням антигенного навантаження: з двох потужних антигенів залишається лише один. Проте з результатів нашого дослідження видно, що справа не тільки в зменшені кількості антигенів.
Отже, можна вважати встановленим, що у хворих на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ інверсія HBeAg одночасно супроводжується і послабленням сенсибілізації до HBсAg. Це пояснює механізм формування толерантності до HBV у хворих з експресією HBсAg і вплив інверсії HBeAg на особливості клінічного перебігу ХГВ – хвороби імунної відповіді.

Послаблення специфічної реактивності імуноцитів до HBсAg у хворих з інверсією HBeAg ймовірно зумовлено високим ступенем гомології обох антигенів, що кодуються одним спільним геном HBV.

Висновки

1. Інверсія HBeAg у хворих на HBeAg-позитивний ХГВ супроводжується поступовим зменшенням сенсибілізації до е-антигену. Особливо важливим є те, що одночасно зменшується сенсибілізація і до HBсAg. Саме цим можна пояснити розвиток толерантності до HBV у хворих на HBeAg-негативний HBV DNA-позитивний ХГВ, хоч в них зберігається експресія HBсAg.
2. Вміст γ-ІНФ та ФНП-α у супернатанті культури лейкоцитів, що стимульована HBeAg або HBсAg, характеризує рівень сенсибілізації лімфоцитів до антигенів HBV.

Література

1. Аммосов А.Д. Гепатит В. – Кольцово: Институт средств медицинской диагностики ЗАО “Вектор-Бест” (НИИ СД), 2005. – 128 с.
2. Дмитриева Е.В., Москалева Е.Ю., Северин Е.С. Роль апоптоза в патогенезе хронически вирусных гепатитов В и С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 2003. – №5. – С. 7-13.
3. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. – Санкт-Петербург: Теза, 1998. – 325 с.
4. Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей / Пер. с англ. – М.: Геотар Медицина,1999.–859 с.
5. Yotsuyanagi H., Hino K., Tomita E.; Toyoda J.; Yasuda K.; Iino S. Precore and core promoter mutations, hepatitis B virus DNA levels and progressive liver injury in chronic hepatitis B // J. Hepatol. – 2002. – Vol. 37, № 3. – P. 355–363.
6. Milich D.R., Chen M.K., Hughes J.L., Jones J.E. The secreted hepatitis B precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence // J. Immunol. – 1998. – Vol. 160. – Р. 2013–2021.
7. Буеверов А.О. Мутации вируса гепатита В их клиническое значение. // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. – 2003. – №4. – С. 7–12.
8. Minuk G.Y., Orr P.S., Brown R. et al. Pre-core mutant infection in the Canadian Inuit // J. Hepatol. – 2000. – Vol. 33. – P. 781–784.
9. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты. (Эпидемиология, диагностика, профилактика). – М.: ГОУ ВУНМЦ. МЗ. РФ, 2003. – 384 с.
10. Герасун О.Б. Клініко-епідеміологічні та імунопатологічні особливості HBeAg-негативного HBV DNA-позитивного хронічного гепатиту В:Автореф.дис. …канд.мед.наук. – 2007. – 25 с.
11. Герасун Б.А., Зінчук О.М., Задорожний А.М., Герасун О.Б. До питання про дослідження антигенної активації імуноцитів за оцінкою вмісту цитокінів у культурі лейкоцитів периферичної крові // Лабораторна діагностика. – 2008. – №2. – С. 25 – 28.

---

Особенности иммунопатогенеза хронического гепатита В с инверсией HbeAg.
О.Б. Герасун

В статье представлены результаты изучения сенсибилизации иммуноцитов у больных хроническим гепатитом В с инверсией HBeAg. Исследование проведено с помощью культуры лейкоцитов периферической крови, стимулированной антигенами HBV. Установлено, что прекращение синтеза HBeAg сопровождается снижением сенсибилизации к HBeAg и HBcAg.

Ключевые слова: хронический гепатит В, инверсия HBeAg, сенсибилизация к антигенам HBV, культура лейкоцитов, γ-ИНФ, ФНП-α.

Peculiarities of immunopathogenesis chronic hepatitis B in patients with HBeAg-inversion.
O.B. Herasun

In the culture leucocytes of peripheral blood, sensitizing to HBeAg and HBсAg in patients with chronic hepatitis B has been studied. It has been stated that HBeAg inversion in patients with chronic hepatitis B with maintains of HBV replication can result in gradual decrease of reactivity immunocytes to HBeAg and HBсAg.