Мир вирусных гепатитов. – Москва, 2006. – № 1. – С. 13-18
Хронические гепатиты В (ХГВ) и С (ХГС) сопровождаются аутоиммунными процессами. Об этом, в частности, свидетельствует выявление у таких больных широкого спектра аутоантител. Чаще других регистрируются антинуклеарные антитела (АНА) разной специфичности, в т.ч. к нативной ДНК и экстрагируемым ядерным антигенам (рибонуклеопротеид и др.). Антитела к ДНК связывают и активируют комплемент, и потому способствуют разрушению клеток, активируют нейтрофилы и макрофаги [5]. Для возникающих при хронических гепатитах системных васкулитов типичны антитела к цитоплазме нейтрофилов (АНЦА), обычно протеазе-3 и миелопероксидазе. Недавно у больных ХГС выявлены новые аутоантигены, относящиеся к другим цитоплазматическим и перинуклеарним структурам нейтрофилов [11,14]. Несмотря на то, что роль АНЦА в развитии васкулитов не до конца ясна, не вызывает сомнений то, что их патогенетическое значение связано с антиэндотелиальной активностью, к тому же они способны вызывать активацию нейтрофилов [10]. Мишени АНЦА продолжают изучаться и спектр их расширяется.
В патогенезе аутоиммунных реакций при хронических вирусных гепатитах (ХВГ) важную роль играет тропизм HBV и HCV к лимфоцитам; мононуклеарные клетки крови, также как гепатоциты, служат мишенью для вирусов. Имеет значение и то, что встраивание антигенов вируса в поверхностные мембраны клеток приводит к изменению HLA и образованию комбинированных антигенов со свойствами аутоантигенов.
Антигенная стимуляция В-лимфоцитов CD-5 сопровождается усиленным синтезом в печени поликлональных и моноклональных IgM (антитела к Fc- фрагменту IgG – ревматоидный фактор), реагирующих с anti-HCV IgG образованием смешаных криоглобулинов. Смешанная криоглобулинемия определяется почти у половины больных ХГС, а RNA HCV имеется у большинства больных с криоглобулинемическим мезангиокапиллярным гломерулонефритом и геморрагическим васкулитом [2,6,7,8,9,13]. Хронический гепатит С часто манифестирует системным васкулитом с пурпурой и нефропатией, реже возникает синдром Рейно [1,11,12,15].
Терапия больных хроническим вирусным гепатитом с аутоиммунными процессами разработана недостаточно, обычно предусматривает, особенно при системных васкулитах, применение глюкокортикостероидных гормонов и цитостатиков, что часто нежелательно или противопоказано больным с интенсивной вирусной репликацией.
В данном сообщении предлагается новый способ лечения таких больных с помощью внутрикожной иммунизации аутолейкоцитами*. Метод применяется самостоятельно либо в комплексной терапии (ангиопротекторы, противовирусные препараты, гепатопротекторы).
Как прототип способа можно рассматривать разработанный В.И. Говалло метод профилактики самопроизвольных выкидышей путем внутрикожной иммунизации беременной женщины лимфоцитами мужа (”обучающий фактор”). После такой иммунизации до того неимунные, по отношению к антигенам плода, лимфоциты беременной женщины становились сенсибилизированными, следствием чего являлась опосредованная стабилизация гормонального дисбаланса [3].
В нашей работе для уменьшения интенсивности аутоиммунных процесов использовались аутогенные лейкоциты. Однако оба подхода (несмотря на принципиальные различия) объединяет то, что иммунизация лейкоцитами/ лимфоцитами применяется с целью воздействия на особенности иммунологических дисрегуляторных процессов.
Материал и методы. Лечению подверглось 20 пациентов (6 ХГВ и 14 ХГС), из них 10 с явлениями васкулита, в т.ч. 7 пациентов с сосудистым поражением кожи. Среди последних два с дермальным некротизирующим васкулитом, 3 с геморрагическим артериолитом Рюитера, одна больная с тяжелым геморрагическим некрозом и один пациент с часто рецидивирующим уртикарным васкулитом. Повышенный уровень AНA выявлен у 12 пациентов в титре ≥ 1:80 (норма до 1:80), а криоглобулинов – у половины обследованных.
Методика внутрикожной иммунизации аутолейкоцитами.
1. Получение аутолейкоцитов. Лейкоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови. Для этого венозную кровь в объеме 10-50 мл (в зависимости от тяжести и продолжительности болезни) набирали в шприц или флакон с гепарином из расчета 50 ед. гепарина на 10 мл крови. Разливали по пробиркам и отстаивали при t – 37ºC 90-100 мин (в зависимости от показателей СОЭ). Из плазмы осаждали лейкоциты, дважды отмывали в избытке охлажденного 0,9% раствора NaCl путем центрифугирования при 200g в течение 10 мин. Осадок ресуспендирували в 1,0 мл раствора NaCl. Никаких других компонентов, в т.ч. обычно применяющихся для создания градиента плотности, мы не использовали. Все этапы роботы проводились стерильно, а манипуляции с лейкоцитами в ламинарном боксе. Количество живых клеток, полученных с помощью описанной методики, превышает 80%. Некоторая примесь эритроцитов, неизбежная при таком получении лейкоцитарной массы, на результаты лечения не влияет.
2. Иммунизация. Суспензию аутоклеток вводили пациентам внутрикожно по 0,1 в 10 точек в кожу спины (между лопатками).
Результаты оценивали по выраженности клинических проявлений, до иммунизации и через 24,48,72 часа после нее, а также в отдаленные сроки через 1,3,6 месяцев, 1-4 года. Учитывали выраженность проявлений кожного васкулита, интенсивность артралгий при суставных поражениях, функциональное состояние почек при гломерулонефрите. Непосредственно перед процедурой и через 48-72 часа после нее определяли содержание AНA методом ИФА. Параллельно трех пациентов обследовали в лаборатории “Доктора Рёдгера” (Берлин, Германия) на наличие АНА и АНЦА методом иммунофлюоресценции. Количество криоглобулинов определяли спектрофотометрически методом E.Kalovidoris (1983). Сопоставляли результаты гематологических и биохимических исследований. У одного больного проводили термографию пораженных участков до и после аутоиммунизации.
Пациенты хорошо переносили иммунизацию аутолейкоцитами, видимые местные и общие реакции отсутствовали.
Результаты, обсуждение
В результате лечения у большинства больных (19 из 20; 95%) наступило улучшение: снижение общей слабости, нормализация активности АлАТ, ускорение обратного развития сыпи у больных с васкулитом, снижение уровня криоглобулинов, ремиссии разной продолжительности.
Приводим клинические наблюдения, иллюстрирующие эффективность лечения.
Больной Р., 46 лет, поступил на лечение в 1998 г. по поводу суперинфекции дельта. В течение 12 месяцев получал интрон-А по 5 млн. в сутки. В результате лечения маркеры репликации (DNA HBV, RNA HDV) исчезли, активность АлАТ нормализовалась, общее состояние улучшилось. Через 7 месяцев после окончания лечения, при отсутствии DNA HBV, периодически стала повышаться активность АлАТ, появились артралгии, после тепловых процедур (ванна, душ) – розеолезная сыпь. При обследовании в лаборатории “Доктора Рёдгера” (Берлин) методом иммунофлюоресценции выявлены AНA в титре 1:80 (норма – до 1:80. При повторном обследовании в этой же лаборатории через 72 часа после иммунизации аутолейкоцитами, указанные аутоантитела не выявлены. Артралгии прекратились, перестали возникать высыпания после тепловых процедур. Однако, по-прежнему периодически отмечалось умеренное повышение активности АлАТ (срок наблюдения 4 года).
Больная Г., 50 лет, по поводу ХГС получала пегинтрон 80 мг в неделю и ребетол 600мг в сутки. Через 4 месяца от начала лечения титр AНA с 1:80 (исходный уровень) повысился до 1:1280. Внутрикожное введение аутолейкоцитов эффекта не дало. Противовирусная терапия была прекращена. Спустя 8 месяцев обратилась с жалобами на общую слабость и артралгии. Обследована методом иммунофлюоресценции в лаборатории “Доктора Рёдгера”, выявлены AНA в титре 1:80, флюоресцентный рисунок нежно-гранулярный (трактуется как указание на возможное начало аутоиммунного заболевания); AНA-митозы – отрицательны, цитоплазма –выявлены АНЦА (как правило это митохондриальные и соответственно Jo-1AT). Через 72 часа после иммунизации лейкоцитами при исследовании в той же лаборатории аутоиммунные антитела перестали определяться. Одновременно прекратились артралгии. Ремиссия сохраняется 3 года (период наблюдения).
Больной Б., 38 лет, поступил на лечение с диагнозом ХГВ, часто рецидивирующий васкулит Рюитера. В течение последних 3 лет регулярно (1-2 раза в месяц) появляются кожные высыпания. Поступил на 3-й день обострения. На коже нижних конечностей, больше в области голеней, обильные отечные воспалительные пятна (3-5 мм) и мелкая геморрагическая сыпь. Общее состояние нарушено незначительно. Через 8 часов после иммунизации на коже предплечий, преимущественно по близости мест введения лейкоцитов, появились более крупные отечные воспалительные пятна размером 6-7 мм. Однако уже через 2 часа они бесследно исчезли, быстро стала угасать и сыпь на ногах. В последующем, в течение 2 лет (период наблюдения), обострений не было.
У больной с ХГС и неходжкинской лимфомой развился тяжелый геморрагический ваксулит с некрозом (поражено более 15% поверхности кожи). Введение аутолейкоцитов оказалось безрезультатным.
Отдельного рассмотрения заслуживают результаты лечения 3-х больных с тяжелой криоглобулинемией. Приводим краткие описания этих наблюдений.
Больная М., 60 лет,. хронический гепатит С (RNA HCV+), криоглобулинемия, тяжелый геморрагичиский васкулит с частыми обострениями. Ремиссия наступила лишь после 4-х кратной иммунизации с интервалом в 1-3 недели.
Таблица 1. Данные исследования холодовых проб у больной М. до и после лечения.
|
Виды криопроб |
До лечения |
После иммунизации |
| Холодовой преципитат плазмы |
+++++ |
+ |
| Холодовые аутогемагглютинины (титр) |
1:128 |
1:8 (норма) |
| Холодовые изогемагглютинины (титр) |
1:64 |
1:32 |
| Криоглобулины (г/л) |
1,46 |
0,67 |
Больная Ф., 40 лет. в анамнезе острый гепатит В., в данное время HBsAg, HBV DNA не выявлены, HBcAb присутствуют. Тяжелая форма криоглобулинемии. В связи с обострением госпитализирована в ревматологическое отделение, где получала терапию ГКСГ, цитостатическими препаратами, плазмаферез. Выписана со значительным улучшением. Однако сохранялась болезненность мелких суставов рук; чувствительность к холоду, хоть и уменьшилась, продолжала беспокоить больную. Сохранялся багрово-синюшный оттенок кистей рук и кончика носа. Через две недели в стадии субкомпенсации проведена иммунизация аутолейкоцитами. Эффект наступил быстро: улучшилось общее состояние, уменьшился цианоз верхних конечностей, около 80%; прекратились боли в суставах, значительно улучшилась переносимость холода. По данным термографии пораженных участков, гипотермия с -5ºС уменьшилась до -2ºС. Активность АЛАТ с 1,7 мкм /л снизилась до 0,45 мкм/л.
Больной К., 42 года, ХГС (генотип 3а), криоглобулинемия: гломерулонефрит, часто обостряющийся геморрагический васкулит (кожно-суставная форма). В стационаре,в день поступления, очередное обострение. Появилась сильная боль и, в последующем, кровоизлияние во втором пальце левой ноги, через два часа – отек и гиперемия кистей рук и левой стопы. В связи с этим проведена иммунизация аутолейкоцитами (через 4 часа после начала обострения). Уже через 18 часов зона гиперемии сократилась примерно на 75-80%, резко уменьшилась отечность. Отмечено ускорение обратного развития «старых» элементов сыпи. Через 10 дней – повторный рецидив, однако протекал легче. Сделана повторная иммунизация. Через 24 часа высыпания и отеки полностью исчезли. В дальнейшем проведено еще 2 иммунизации. Частота обострений уменьшилась, течение их стало легким, с быстрым обратным развитием. Эффект частичный, стойкой ремиссии добиться не удалось. Вместе с тем достигнуто значительное уменьшение явлений нефропатии. До того стабильная значительная концентрация белка в моче (3-3,5 г/л) снизилась до 0,47 г/л и в дальнейшем колебалась от 0,2 до 0,5 г/л (продолжительность наблюдения 7 месяцев).
У большинства больных внутрикожное введение аутореактивных лейкоцитов сопровождалось снижением количества АНА (при исследовании уже через 24-72 часа). Результаты исследования приведены в Таблице 2.
Таблица 2. Титры AНA до и через 72 часа после внутрикожного введения аутолейкоцитов.
|
Исходные титры AНA |
Титры AНА после аутоиммунизации |
||||||
|
0* |
1:20 |
1:40 |
1:80 |
1:160 |
1:1280 |
Всего пациентов |
|
|
1:80 |
3 |
3 |
|||||
|
1:160 |
2 |
1 |
3 |
||||
|
1:320 |
2 |
1 |
1 |
4 |
|||
|
1:640 |
1 |
1 |
|||||
|
1:1280 |
1 |
1 |
|||||
* – число больных с соответствующим титром АНА.
Из приведенных в таблице данных видно, что у больных с исходным титром АНА 1:80, после иммунизации антитела выявить не удавалось. У остальных – кратность снижения составляла 4-16. В одном наблюдении эффект отсутствовал.
В целом же, данный метод лечения, как видно из таблицы 2 и приведенных наблюдений, зарекомендовал себя положительно.
Эффективность внутрикожной иммунизации аутолейкоцитами можно объяснить комплексным воздействием аутореактивных клеток на механизмы иммунного ответа. Известно, что клетки, извлеченные из организма и подвергнутые даже простейшим, мало травмирующим манипуляциям, в известной мере становятся для организма чужими. По-видимому, это усиливает иммунологическое реагирование, возможно за счет активации неспецифических факторов иммунитета (система комплемента, макрофаги и др.). Предполагается, что в условиях внутрикожной иммунизации лимфоцит периферической крови утрачивает часть защитных механизмов (страдает способность к изменению формы и «маскировке» рецепторов). Возможно, имеет место и перекрестное реагирование за счет частичной идентичности антигенных структур. Так или иначе, лишь взаимодействием между иммунизирующими клетками (мишень) и аутоантителами можно объяснить довольно быстрое снижение концентрации последних. В пользу такой возможности свидетельствует и то, что в опытах in vitro АНА реагируют с лейкоцитами; для выявления АНЦА в качестве субстрата используют фиксированные этанолом нейтрофилы.
Однако, лишь взаимодействием с антителами нельзя объяснить отдаленные результаты лечения. Известно, что Т-лимфоциты могут пассивно переносить аутоиммунные болезни [4]. Из этого следует, что при внутрикожном введении аутореактивные клетки могут вызывать состояние активности клеточного лимфоцитарно опосредованного иммунного ответа, т.е. запускать противовирусный надзор, за счет генерации цитотоксических лимфоцитов [4,16]. Важным является и процесс коррекции сети Эрне – идиотип-антиидиотипической регуляции иммунного ответа, что подтверждается ростом антиидиотипических антител в сыроватке крови больных после лейкоцитарной аутоиммунизации [4]. Еще один механизм может включиться при этой иммунной манипуляции: активация CD3+, CD4+, CD25+-лимфоцитов, а также CD3+, CD8+, CD28+-лимфоцитов, одновременно с блокированием Fc-рецепторов, а также гликопротеиновых, лектиновых рецепторов на В-лимфоцитах [4,15].
Известно также, что в периферической крови взрослых людей содержится некоторое количество стволовых клеток [4]. Не исключается, что при внутрикожном введении они могут способствовать процессам роста и регенерации сосудов. Во всяком случае, на такую возможность указывает динамика восстановительных процессов у больных с поражением мелких сосудов кожи.
Список литературы
- Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь – вирусные гепатиты. Русско-украинское издание. Львов: ЛДМУ, 2000 – 584 с.
- Вермель А.Е. Криоглобулины и криоглобулинемия // Клин. Мед.- 2000.- №12.- С.14-19.
- Говалло В.И., Сидельникова В.М. Иммунизация беременных женщин аллогенными лимфоцитами мужа как метод профилактики самопроизвольных выкидышей // Акуш. и гин. – 1983. – №12. – С. 25-27.
- Імунологія. М. Якобисяк / перевод с польського под ред. В.В. Чопьяк. – Винница: Нова книга, 2004. – 672 с. (укр.)
- Клиническая иммунология и аллергология. Под ред. Г. Лолора-младшего, Т. Фишера, Д. Адельмана . // Перевод с англ. М., Практика, 2000. – 806 с.
- Козловская Л.В., Мухин Н.А., Гордовская Н.Б. и соавт. Факторы риска прогрессирования криоглобулинемического гломерулонефрита, связанного с вирусом гепатита С. // Клин. мед. – 2001. – № 4. – С. 32-35.
- Константинова Н.А.//Криоглобулины и патология.- М.:1999.-176с
- Малый В.П. HCV-инфекция (острая и хроническая)/ Киев., – 2005.- 295 с.
- Мухин Н.А., Козловская Л.В., Малышко Е.Ю. Криоглобулинемический нефрит, ассоциированный с хронической инфекцией вируса гепатита С. // Тер. арх. – 2000. – №6. – С. 1-5.
- Насонов Е.Л., Баранов А.А., Шишкина Н.П. Васкулиты и васкулопатии. – Ярославль: Верхняя Волга, 1999. – 616 с.
- Чоп’як В.В.,Господарський I.Я. Клінічний протокол надання медичної допомоги хворим на поліклоновукріоглобулінемію//Метод.рекомендації.-К.,2005,-23 с.
- Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчных путей. // Перевод с англ. М. Гэотар Медицина 1999. – 864 с.
- Ferri C., Zignego A.L., Pileri S.A. Cryoglobulins // J. Clin. Pathol.- January 1, 2002.- V.55 (1).- P.4-13.
- Lamprecht P, Gutzeit O, Csernok E. et al. Prevalence of ANCA in mixed cryoglobulinemia and chronic hepatitis C virus infection // Clin. Exp. Rheumatol. – 2003. – Vol. 21. – Р. 89-94.
- Renversez J.C., Roussel S., Valle M.L., Lambert P.H. // Antiglobulins, cryoglobulins and glomerulonephritis// Ed. By ponticelly C., Minetti L., D’Amico G.D. – Dordrecht, Boston, Lancaster: Martinus nijhooff. -1996 -P.147-160
- Trendelenburg M., Schifferli J. Cryoglobulins are not essential // Ann Rheum Dis. – 1998. – V.57. – P.3-5.